Способ определения липополисахаридных антител против грамотрицательных микробов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК РЕТЕНИЯУ ОПИСАНИЕ ИЗОБК АВТОРСКОМУ С ВИДЕТЕЛ ЬСТ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ МИКРОБОВ(57) Изобретение относится к области медицины, в частности инфекционной иммунологии, и может быть использовано дляопределения антибактериальных противолипополисахаридных антител ЛПС - антири части: 0-специ Изобретение относится к области медицины, в частности инфекционной иммунологии, и может быть использовано для определения антибактериальных противо.- липополисахаридных антител (ЛПС-антител),Тяжелые токсические состояния и токсические шоки при бактериальных инфекциях и сепсисе связаны с разрушением бактерий и освобождением зндотоксина. Антибиотики, которые широко применяют при серьезных грамотрицательных инфекциях, вызывая разрушение бактерий, способствуют освобождению эндотоксинов, попаданию их в кровь и ухудшению состояния больных.Эндотоксины гртерий имеют сложнуиз белка и ЛПС. ЛПС еская часть, кор и лиамотрицательных бака структуру и состоят условно разделяют на ГОСУДАРСТВЕННЪЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР е.Цао 1772759 А 1(я)з 0 01 И 33/535 тел). Целью изобретения является повышение точности способа определения ЛПС-антител за счет выявления общего для грамотрицательных бактерий антигена. Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена в ИФА или для приготовления диагностикума для РПГА используют ЛПС из Ремутачта Яа 1 топеИа аппезота, не содержащий примесей с чистотой содержания гексозаминов, Изобретение можно использовать на производстве препаратов крови для отбора сывороток с высокими титрами ЛПС-антител, которые можно применять для лечения септических больных. Изобретение может быть использовано и для наблюдения в динамике за септическими больными, что представляет ценность ввиду быстроты получаемого ответа 1 табл,пид А, 0-специфические цепи различных видов бактерий сильно отличаются друг от друга по химическому строению и этим определяют серологическую специфичность. Кор и липид А у различных видов грамотрицательных бактерий имеют подобные структуры, В настоящее время для всех энтеробактерий описано 6 кор-типов (В- К 4, К - 12 Е.со 11- тип и йа-тип Яа 1 гпопе 11 а, отличающихся вариабельностью строения наружной части, проксимальной к О-цепи. Внутренняя область кор, проксимальная к липиду А, имеет более общее строение, Липид А является наиболее консервативной частью молекулы и представляет собой дисахарид, состоящий из двух глюкозаминовых остатков, к которым присоедины цепи жирных кислот, фосфат и этзноламин. В на 17727595 30 стоящее время детально установлена структура двух типов липида А: Со 1-тип и Яа 1 еопеИа-тип. Однако авторы предполагают наличие 4 типов липида А, другие сообщают о микрогетерогенности молекул липида А, различающихся по количеству цепей жирных кислот и количеству замещений фосфатом и этаноламином.Липид А с укороченной частью кор, состоящей из двух молекул КДО (2-кето-дезоксиоктоновая кислота) встречается в структуре ЛПС практически всех грамотрицательных микроорганизмов. Именно эта часть молекулы ЛПС отвечает эа токсичность эндотоксинов. Липид А нерастворим в воде, э присутствие двух молекул КДО кор-области делает его молекулу водорастворимой. Такое строение ЛПС (липид А+ 2 молекулы КДО) обнаружено в Йе-мутантах бактерий, которые утратили некоторые ферменты и поэтому неспособны включать О- специфическую цепь и значительную часть кор в ЛПС.Антитела к ЛПС из Я-форм бактерий при парентеральной иммунизации животных образуются только к О-специфической цепи, но не к кор или липиду А и поэтому не могут нейтрализовать токсическое действие кор и липида А. Парэнтеральная иммунизация ЛПС кор-дефектных мутантов Ва-Вб вызывает образование антител, специфичных к терминальным углеводным остаткам, а антитела против субтерминальных и глубоких структур кор или липида А не образуются, Наибольший практический интерес в плане перекрестной защиты представляют антитела к липиду А и ЛПС Ве-мутантов, состоящему из липида А и двух молекул КДО, структур, обнаруженных во всех грамотрицательных бактериях. Антитела, направленные против этих структур Ве-мутэнтов должны нейтрализовать токсическое действие эндотоксинов всех грамотрицэтельных микробов, И при проверке оказалось, что среди всех испытанных антител к В-мутантам(Ве-Ве) перекрестно защищать животных от гибели могли только антитела к Ве-мутанту Я. а 1 ппеэо 1 а и Вс-мутанту Е, со 11, За рубежом имеются данные по применению плазмы или сыворотки крови с повышенными титрами ЛПС-антител больным с токсимией и сепсисом. Смертность больных сепсисом составляет обычно 60 - 80. Применение плазмы или сыворотки с повышенными титрами ЛПС-антителзначительно увеличивает выживаемость больных при сепсисе,Известен способ определения антител к ЛПС методом РПГА на основе диагностикума с "Ве-гликолипидом" Я, аппезота. Од 15 20 25 30 35 40 45 50 нако, отобранные на его основе сыворотки крови обнаруживали слабый протективнцй эффект на мышиной модели, При иммунизации добровольцев кипяченым Ве-мутантом 3. гп 1 ппезо 1 а не обнаруживали повышения титров в "Ве-гликолипиду", т,к. антиген был маскирован примесями.Прототипом можно счиать работу, в которой определение ЛПС-антител проводят методом ИФА. При этом используют ЛПС,полученный иэ Я-форм бактерий по методу Вестфаля, При таком определении ЛПС-антител имеется ряд недостатков: во-первых, с помощью ЛПС 5-форм бактерий выявляются антитела к О-специфической цепи, принадлежащие к 19 б-классу, которые являются специфичными для каждого вида и даже штамма микробов, во-вторых, антитела против кор и липида А, общие для грамотрицательных микробов, принадлежащие к 9 М-классу, не выявляются совсем, и, в- третьих, используется недостаточно очищенный антиген, т,к. препараты ЛПС по Вестфалю содержат примеси (до 37, белка и 3 нуклеиновцх кислот), что затрудняет выявление ЛПС-антител. Сыворотки с повышеннцми титрами ЛПС-энтител в работе- прототипе были более эффективны в лечении сепсиса, чем иммуноглобулины 19 б-класса, полученнцй из них, так как основная защита от токсического действия ЛПС связана с 19 М классом антител.Целью настоящего изобретения является повышение точности способа определения ЛПС-антител за счет выявления общего для грамотрицэтельных бактерий антигена, Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена в ИФА используют ЛПС иэ Ве-мутанта Затопе 1 э е 1 ппезота, не содержащий примесей белка, нуклеиновых кислот, полисахаридов, липидов (других, кроме липидэ А). О-специфической цепи, частей кор(кроме двух молекул КДО), Антиген ЛПС из Ве-мутанта может быть получен любым иэ известных методов получения ЛПС и затем доочищен, чтобы гарантировать отсутствие в нем примесей. Однако, препарат ЛПС получают наиболее высокой степени чистоты, если выделение ЛПС из Ве-мутанта проводят с фенол-хлороформ-петролейнцм эфиром по методу бэ 1 апоз. Кроме высокой сгепени очистки препарата ЛПС этот метод гарантирует и хороший выход - до 5,5, тогда как по методу Вестфаля выход - 0,6. Доказательство отсутствия в антигене примесей белка, нуклеиновых кислот и полисахаридов проводят любыми известными методами. Гарантией высокой степени чистоты ЛПС Ве-мутанта служит содержание гексозаминов, равное 17 оь или 1030 нмо 1772759ля/мг(при высушивании до постоянного веса), что соответствует теоретически вычисленным.Наличие примесей в препарате ЛПС наиболее быстро контролируют высокочувствительным методом с карбоцианиновым красителем (7) по визуальному изменению цвета и сдвигу максимума поглощения в видимой части спектра, указывающего на присутствие белка, нуклеиновых кислот или полисахаридов,Антиген, полученный по методу ба 1 апоз хорошо растворялся в воде, хорошо сорбировался.на планшеты для ИФА и после обработки щелочью хорошо сорбировался на эритрацитах при приготовлении диагностикума, Использование этого антигена в ИФА доказывает, что ан выявляет антитела 9 Ы- класса, т.к, работы системы требуются коньюгаты антител к 19 Ы-человека,При выделении из антигена липида А получают нерастворимый препарат, использование которого в качестве антигена усложняет способ, т.к, ведет к необходимости перевода липида А в растворимую форму,Постановку ИФА осуществляют обычным образом.П р и м е р 1. Определение содержания ЛПС-антител на основе ЛПС йе-мутанта Я, п 1 ппезо 1 а методом ИФА.Высушенную спиртом микробную массу Йе-мутанта Я, т 1 ппезо 1 а трижды экстрагируют смесью 90 О фенал (свежеперегнанный)-хлороформ-петролейный эфир (кип, 40 - 60 С) в соотношении 2:5:8. Объединенные надосадочные жидкости упаривают в роторном испарителе для удаления хлороформа и петролейного эфира. К оставшемуся фенолу, начинающему кристаллизоваться, добавляют воду да полного его растворения. Далее воду добавляют по каплям до выпадения в осадок ЛПС, соблюдая осторожность, чтобы не вызвать расслоения фенола избытком воды, Осадок ЛПС собирают центрифугированием, промывают 800/, феналам и трижды эфиром, досушивают в вакууме,Доказательство отсутствия в антигене примесей белка, нуклеиновых кислот и палисахаридав проводят карбоцианиновым красителем па определению максимума поглощения антигена в видлмай части спектра. Антиген имел максимум поглощения при 467 нм, чта свидетельствовало об отсутствии примесей, и превышал процентное содержание ЛПС в стандартном препарате ЛПС из Е= соН 055: В 5 фирмы "ООсо", США, полученному по методу Вестфаля.В препарате ЛПС определяли содержание гексазаминав. которое оказалось рав 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ным 174 на сухой вес прегарата, Такой высокоо-ищенный препарат был использован в ИФА в качестве антигена для нанесения на планшет или для приготовления диагностикума для постановки РПГА,При постановке ИФА способ осуществляют следующим образам; очищенный антиген наносят в рабочей концентрации 5 мкг/мл в лунки полистироловых планшетов для ИФА в объеме 0,2 мл, В качестве сарбирующего буфера используют 0,05 Ы карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6, Сенсибилизацию пластин проводят в течение 16-20 часов при температуое 4 С, после чего отмывают фосфатно-буфернай смесью, содержащей 0,054 твин. Затем наносят исследуемые образцы сывороток крови, или препаратов иммнуноглобулинав, или осадка Б, получаемого при фракциониравании сывороток крови по метод, Кона (фракция Ш) в разведении 1;50 - 1:1600, после инкубации отмывают и наносят коньюгат антител к иммуноглсбулину Ы человека с пероксидазай хрена. Время инкубации сывороток и конъюгата - 1 и 1,5 ч при 37 ОС, После отмывки ферментативную реакцию проявляют, добавляют субстрат, содержащий 0,003% Н 202 и 0-фенилендиамлн (ОФД) в 0,05 цитратно-фосфатнам буфере рН 5,0, Через 30 мин стояния реакцию фиксируют добавлением 14НзЯО 4 и учет интенсивности окрашивания проводят на фатаметре "Т 1 егтЖ ЫШз 1 сап" при 492 нм,Методом ИФА обследована 34 пулевых сыворатоккровиобьемомпа 5 л слитыхат 30-40 индивидуальных порций. из них - 13 донорских и 21 плацентарнце сыворотки. из 17 городов РСФСР, поступающих на предприятие УНИИЭЫ им. Г,Н. Габричевского для фракцианиравания па методу Кона, Результаты титравания обнаружили содержание ЛПС-антител в пулавых сыворотках в титрах от 1:50 да 1;1600, Стабильно высокие титры обнаружены в пудовых сыворотках из г. Ленинграда (титр 1:800 в 6 из 7 исследованных абразцав), на втором месте па высоте титров оказались пулавые сыворотки из г, Пскова (титр 1;400 в 2 из 2 образцов). В образцах сывороток из г, Архангельска титры 1;200 были обнаружены в 3 из 4 исследованных, а в образцах из г, Смоленска - 1 образец 1:200, другой 1:1600.При анализе заболеваемости острыми кишечными инфекциями неустановленной этиологии, дизентерией и сальманеллами за последние 2 года именна в этих городах отмечена высокая частота заболеваний, а высокие титры антител к кар и липиду А сохраняются в течение 2-3 лет, Следовательно. именна сываратацнсе сырье из ме 17727595 10 15 20 50 стностей с высоким уровнем заболеваемости, вызванной грамотрицательными микробами, можно рассматривать как источник для получения иммуноглобулиновых препаратов направленного действия,П р и м е р 2. Определение содержания ЛПС-антител в РПГА с диагностикумом на основе ЛПС иэ Ве-мутанта 3. е ппеэо 1 а,Диагностикум для постановки РПГА готовят следующим образом. 5 мг антигена обрабатываю 1,25 мл 0,02 М раствора йаОН при 37 С в течение 16 ч, после чего нейтрализуют 0,02 М раствором НО и доводят обьем до 10 мл физраствором, после чего смешивают с 1 мл плотного осадка отмытых физраствором свежих эритроцитов. Смесь инкубируют 2 ч при 37 С периодически встряхивая, после чего эритроциты 3 раза отмывают физраствором и доводят обьем до 50 мл.Методом РПГА обследовали 34 пуловых сыворотки, 12 осадков Б и 10 индивидуальных сывороток от больных пиелонефритом. Во всех исследованных образцах обнаружены ЛПС-антитела в титрах от 1:80 - 1;640, Определения РПГА проведены параллельно с методом ИФА в одних и тех же образцах и обнаружено значительное совпадение результатов титров (расхождение между РПГА и ИФА не боле, чем в два раза),Результаты определения содержания ЛПС-антител на основе предлагаемого антигена-ЛПС из йе-мутанта Я, е 1 ппеэо 1 а методами ИФА и РПГА в 10 индивидуальных сыворотках больных пиелонефритом приведены в таблице в сравнении с О-специфическими антителами, определяемыми с коммерческими ЛПС из Я-форм микробов.Из данных таблицы видно, что содержание О-специфических антител не всегда коррелирует с содержанием анти-йе-ЛПС-антител в сыворотках крови у индивидуальных больных. Эта разница стирается при сравнении пуловых сывороток и осадков Б,РПГА проще в исполнении, чем ИФА, но менее экономична, т.к. расход антигена в 100 раз больше,Технико-экономическая эффективность изобретения. Изобретение может быть использовано для определения состояния иммунной системы в динамике у больных серьезными грамотрицательными инфекциями и сепсисом. Нарастание ЛПС-антител у таких больных свидетельствует о том, что иммунная система больного справляется с инфекцией и отвечает выработкой антител. Уменьшение ЛПС-антител у больных сепсисом - плохой прогностический признак, приближение летального исхода,Изобретение может быть применено для обследования нанесения для выявления группы риска, со сниженными титрами ЛПС-антител, лиц, которые могут погибнуть от сепсиса, Особенно велик будет процент таких у подвергшихся радиоактивному облучению,Можно испольэовать изобретение и для выявления лиц с высокими титрами ЛПС-антител, которые могут быть донорами крови; так как такие йе-ЛПС-антитела сохраняются в организме в течение 2-3 лет на высоком уровне.Изобретение может быть использовано на производстве препаратов крови путем отбора сывороток с повышенными титрами Яе-ЛПС-антител и изготовления из них иммуноглобулиновых препаратов 1 цМ-класса, эффективных в лечении токсемий и сепсиса, вызванного любыми грамотрицательными микробами.Показано, что для этих целей может быть использован бросовый осадок Б, получаемый при фракционировании крови по методу Кона, а кровь для фракционирования следует брать иэ местностей с высоким уровнем заболеваемости за последние 2-3 года, вызванной грамотрицательными микробами.Формула изобретения Способ определения липополисахаридных антител против грамотрицательных микробов, включающий выделение антигена, нанесение его на носитель, внесениеисследуемой сыворотки и учет иммунологической реакции при иммуноферментном анализе, отл и ч а ю щи й с я тем, что, с целью повышения точности способа эа счетвыявления общего для грамотрицательныхбактерий антигена, в качестве антигена используют Ве-мутант БааопеПа гпппЕзоа при уровне содержания гексозаминов 17:10 1772759- В квчесеннцй по м Г.Крюковргентал ставит хред М Редактор рректор Н. Бучок 3844 Тираж ПодписноеИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС113035, Москва, Ж, Раушская наб;, 4 И Зэка оизводственно-издательский комбинат Патент", г. ул. Гагарина, 10 тве антигена на планает етоду Вестфаля, фирмы " - Коммерческий О-диагностикум,вносили коммерческий ЛОС иэ Е.соН 055; В 5Оосо." СШД.