Штамм бактерий соrynевастеriuм sереdоniсuм продуцент полисахарида, индуцирующего образование интерферона

СООЗ СОВЕ ГСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ 1756349 СПУБЛ 12 й 1/20, С 12 Р 19 ЕН ййОВ- ТЕХЮ%.ВИЬЯИОТ У ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ И К АВТОРСКОМУ СВИДЕТ(56) Ермольева З.В., Вайсберг Г,Е. Стимуляция неспецифической резистентности организма и бактериальные полисахариды. - М.:Медицина, 1976, с. 187,(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ООВУЙЕВАСТЕЯОМЗЕ Р ЕООМ 1 СОМ - ПРОДУЦЕ НТ ПОЛ И САХАРИДА, ИНДУЦИРУЮЩЕГО .ОБРАЗОВАНИЕ ИНТЕРФЕРОНА(57) Использование; полисахарид можетбыть использован в профилактике и лечении Изобретение относится к микробиологии, а именно к штаммам микроорганизмов, используемых в микробиологической и медицинской промышленности для получения иммуномодуляторов, в частности полисахаридов, обладающих способностью индуцйровать образование интерферона в клетках человека и животных,Известен продуцент полисахарида Вастегца ргоб 91 озап, получившего название продигиоэан, который проявляет интерферониндуцирующее действие.Выращивание указанного продуцента проводится на средесодержащей дорогостоящие реактивы - мясо-пептонный буль 2опухолевых процессов, а также различных иммунодефицитных состояний. Сущность изобретения: Штамм СогупеЬастегОи зеребопси ВНИИА 1857 является продуцентом полисахарида. индуцирующего образование интерферона с высокой активностью, Штамм СогупеЬас 1 ег цгп зереоопсцв выделен из клубней картофеля. При росте на жидкой синтетической среде, в которой в качестве источника азота используется хлористый аммоний, а углерода - глюкоза стоимость 1 л среды составляет 16 коп), клетки синтезируют полисахарид, обладающий способностью индуцировать образование интерферона лейкоцитами периферической крови человека, а также культурами мышиных фибробластов. Полисахарид сосгоит из следующих моносахаридов: рамнозы и галактозы. Кислая природа полисахарида обусловлена присутствием пировИног- Я радной кислоты. 2 ил. 1 табл,он, мясо-пептонный агар. Стоимость 1 л среды для выращивания В. ргоб 19 озци составляет 2 руб,Для получения продигиозона густой смыв культуры В. ргосИ 9 овца штамм К обрабатывают многократно 0,5 М раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) при 4 С. Обьединенные экстракты тщательно освобождают от взвешенных частиц на центрифуге при 10-12 тыс, об/мин и осаждают на холоду шестью объемами охлажденного этанола с добавлением насыщенного спиртового раствора уксуснокисвого натрия из расчета 33 мл/л, После полного выпадения осадок отдекляют на центрифуге и подвергают диализу в течение 3-сут в проточной водопроводной воде и 24 ч в дистиллированной воде, После диализа препарат подвергают лиофильной сушке. В нем обнаружены следующие моносахариды; глюкоза, галактоза, манноза. глюкозамин.Продигиозан является токсичным, максимально переносимая доза в опытах на белых мышах составляла 0,125-5,0 мг/кг, ЛД 50 равнялась 2-2,5 мг/кг, активность 16-64 ед.Недостатками известного продуцента являются: выращивание продуцента осуществляется на дорогостоящих средах; низкая активность продигиозана; токсичность продигиозана.Целью изобретения является получение нового штамма - продуцента полисахарида, проявляющего активность индуктора интерферона.Новый штамм С. зеребоп 1 сце ИМВ 7694, обладающий указанными выше свойствами, выделен из больных клубней картофеля, Для этой цели часть пораженной ткани на границе с внешне здоровой тканью вырезают стерильным скальпелем, промывают в течение 15-20 мин несколькими порциями стерильной воды. Затем растительную ткань растирают в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды и образующуюся гомогенную кашицу высевают петлей на поверхность агара на чашках Петри. Чашки помещают в термастат (температура 25 й 3) С. Питательными средами для выделения бактерий обычно служат: картофельный агар; картофельный агар+ 1 дрожжевого автолизата; агар картофельный + 1 глюкозы; мясопептонный агар.Культуру хранят: э/в пробирках на косяках с картофельным агаром при комнатной температуре, б/в пробирках на косяках с картофельным агаром, поверхность которого заливают растительным маслом.Состав среды картофельный агар. на 1 л дистиллированной воды 200 г картофеля.0,5% хлористого натрия, 1,5-2,0 оагара, рН 7,0-7.2,Штамм С. зеребоп 1 сцщ ИМВ 7694 депонироввн в коллекции культур Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков Минмедпрома и имеет регистрационный номер 1857.Штамм С. зеребоп 1 соа ВНИИА 1857 имеет следующие морфологические и биохимические признаки,Культурально-морфологические свойства - хорошо растет на обычных питательных средах.На картофельном агаре - колонии кру лые, гладкие, приподнятые, блестящие, сл бо слизистые, желто-оранжевые,На мясо-пептонном агаре - колонии круглые, гладкие, более прозрачные, чем при росте на картофельном агаре, слабо слизистые, желтого цвета, со временем мэслообразной консистенции.При росте в мясо-пептонном бульоне - культура растет умеренно, образует нежную пленку и небольшой осадок,Культура растет в ээробных условиях, оптимальня температура роста (25 + 3)С, минимальная 3-4 С, максимальная 305 10 15 31 ОС. рН; оптимальное 7,0 + 0,2; растут в интервале рН от 6,7 до 7,4,Физиолого-биохимические и ризнаки. Культура не образует кислоту из глюкозы, мэльтозы, мелецитозы, инулина, лактозы, сахарозы, мэннита, салицина, дульцита, сорбита, Не образует сероводород, индол, нитраты не редуцирует, молоко слабо пептонизирует, не разжижает желатины,Использует ацетат, сукцинат, не использует лактат и пропионат,Факторы роста - биотин, никотиновая кислота, гистидин, пурин, пиримидин, метионин, аспарагин. Цистеин и другие аминокислоты могут ингиби ровать рост бактерий,Штамм С. зеребопсне ИМВ 7694 при 20 25 30 культивировании на жидкой синтетической среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, а азота - хлористый аммоний, сйнтезирует полисахарид, обла 35 дающий способностью индуцировать образовэние интерферонэ в клетках человека и животных,Безвредность, Штамм С. зеребопсапИМВ 7694 не вирулентен, не токсичен для 40 теплокровных животных, Введение 24-часовой культуры С, зеребоп 1 сое ИМВ 7694 внутрибрюшинно, подкожно и перорально в дозах 5 и 1 О млрд микробных клеток на 1 мышь, а также фильтратов среды роста 45 (после культивирования культуры на жидкой синтетической среде) не вызывало у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов 50 животных.Штамм 7694 С. зеребоп 1 сцв не патогенен для теплокровных животных.В ыращиавние бактериальной массы С.зеребоп 1 сцгп ИМВ 7694 и получение пол исахарида осуществляли следующим образом, Для получения.инокулята используют 24-часовую культуру, выращенную нэ картофельном агаре при(25.ф.З)С. Выращивание продуцента осуществляют в колбах обьемом 500 мл, содержащих 200 мл жидкой синтетической среды следующего состава. г/л: М 9504 0,2 Иа 2 НРОл 6,0, КН 2 РО 4 3,0; ИНС 1 1,0; глюкоза 5,0.Выращивание культуры продуцента осуществляют при (25 ". 3) С в течение 35-41 ч, целевой продукт выделяют мягким щелочным гидролизом целых клеток.П реме р 1, Культуру С. веребоп 1 сцсп ИМВ 7694, хранящуюся на косяках с картофельным агаром, засевают на косяк с той же средой и выращивают в термостате при (25 + 3) С в течение 24 ч, Затем культуру смывают с косяков жидкой питательной средой описанного выше состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие 200 мл аналогичной питательной среды; выращивают на качалках (240 об/мин) в течение 31 ч. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 - 25 мин, промывают физиологическим раствором и подвергают гидролизу в 5%-ном растворе КОН (100 мл на 10 г влажных клеток) в течение 1,5-2,0 ч. Гицролизат диал изуют и рати в водо п роводной, а затем дистиллированной воды до нейтрального значения рН, центрифугируют для осаждения неразрушенных клеток, а также загрязняющих компонентов клеточной стенки при 5000 об/мин в течение 20 - 25 мин, Полисахарид осаждают из надосадочной жидкости добавлением 5-ти объемов спирта. Осадок полисахарида освобождают от липидов последовательной обработкой ацетоном, эфиром, а затем смесью хлороформа с метанолом (2:1) и подвергают ионообменной хроматографии на ДЗАЭ-ТСК геле. Полисахарид, целевой продукт, элюируют 0,50 М раствором ИаН 2 РОс, рН 6,0. Фракции полисахарида собирают, диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды, лиофильно высушивают,Гомогенность полисахарида показана гель-фильтрацией на сефарозе 6 В (фиг.1), В целевом продукте содеркится 80 -с. 5 углеводоров,Моносахаридный состав целевого продукта изучали методом газожидкостной хроматографии (фиг,2), а также С-ЯМР спектроскопии. Установлено, что полисахарид состоит из тетрасахаридных повторяющих звеньев, представленных остатками рамнозь 1 (двумя) и остатками галактозы(двумя), к С 4 и С 6 которой присоединяется пировиноградная кислота,Молекулярная масса полисахарида; установленная методами гельхроматографии на сефарозе 6 В, а также седиментации и диффузии, составляет60 000,Выход очищенного полисахарида составляет 4-5; сухой массы клеток.Полученный полисахарид проверяютна интерферониндуцирующую активность,5 Индукцию интерферона в опытах ич 1;го проводили внесением в суспензиюлейкоцитов периферической крови человека (5 10 клеток/мл) полисахарида в конечбной концентрации 200 мкг) в пробе. Смесь10 инкубируют при 37 С в течение 24 ч, затемцентрифугируют, В опытах 1 п чсчо животным(мыши линии СВА с массой 18-20 г) внутрибрюшинно вводят полисахарид в дозе 10 и100 мкг/мышь в 0,5 мл. Через 4 и 24 ч после1.5 введения полисахарида мышь декапитируют и собирают пул сывороток, получают. спленоциты общепринятым методом путемразволокнения ткани селезенки. Ложныйсывороточный интерферон получают, вво 20 дя животным вместо полисахарида аллантоисную жидкость. В полученном материале(сыворотки, суспензии спленоцитов, культуральная среда) определяют активность интерферона по способности подавлять25 цитотоксическое действие вируса-индикатора (вирус везикулярного стоматита -ВВС), 100 тканевых цитопатогенных доз(ТЦД)мл. Учет результатов проводили через48 ч. За единицу активности принимают ве 30 личины, обратные максимальному разведению интерферона, предотвращающему на500/, цитопатическое действие 100 ТЦД ВВСв культуре перевиваемых человеческих лейкоцитов линии Ь 1 или культурами мышиных35 фибробластов линии929 соответственно,Тип интерферона определяют по ингибированию активности интерферона специфическими моноклональными антителэми кпрепаратам у - и а-типам человеческого40 интерферона.В опытах 1 п ч 1 го интерферониндуцирующая активность полисахарлда составила1920 + 580 И Е 5 о/мл.При изучении интерфероногенной ак 45 тивости в опытах и чиччо былоустановлено,что внутрибрюшинное введение его в дозе0,5 - 5,0 мг/мг спустя 4 ч вызывает образование интерферона в селезенках и сывороткахкрови мышей, При этом оказалось, что вве 50 дение полисахарида в дозе 0,5 мг/кг вызывало продукцию интерферона гораздоболее эФФективнее по сравнению с другими исследованными дозами,При сравнительном изучении интер 55 фероногенной активности известных препаратов продигиозана установлено, чтопредлагаемый полисахарид более эффективен (табл.).Предлагаемый полисахарид не является токсичным даже в дозе 40 мг/кг (ЛД 50 продигиозана равна 2-3,5 мг/кг)., не обладает побочными эффектами, Продигиозан вызывает повышение температуры тела примерно у 30 больных через 2-4 ч после иньекции до субфебриальных цифр.Таким образом, предлагаемый нами штамм 7694 С, зеребопсов является новым штаммом, продуцирующим полисахарид, являющийся активным индуктором у-интерферона,Выращивание культуры продуцента более, чем в 10 раз дешевле выращивания В. ргоб 1 дозщп.Полисахарид в отличие от продигиозана является токсичным и не обладает побочными действиями. Изобретение может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности, при этом не требуется дополнительных ассигнований для осуще ствления технологических процессов выращивания продуцента и выделения из него полисахарида,Интерфероногенная активность полисахарида СогупеЬастег 1 це зересопсов 10 ИМВ 7694 и продигиозана Вастег 1 овргос 1 доозце приведена в таблице.Формула изобретения15 Штамм бактерий Согупебастег 1 ощзеребоп 1 соа В 1-1 ИИА 1857 - продуцеит полисахарида, индуцируащего образование интерферона,.Рогули аэ 3 О 62 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственноо комитета по изобретениям и открцтия113 О 35. Москва, К, Раушская наб., 4 В НТ СССР,йроиаводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101