Способ определения модификационных изменений белкового комплекса зерна

/02, А О 1 Н 1/ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ПЬСТ АВТОРСНО(57) Использование: сельское хозяйство, биотехнология, селекция и семеноводство. Сущность изобретения:изучают инфракрасный спектр проламина исследуемого и стандартного сортообразцов, определяют оптическуюплотность в максимумах, рассчитываютотношениезначения оптической плотности в максимуме при 1710-1730 смк значению оптической плотности вмаксимуме при 1650-1660 см и по возрастанию его у исследуемых образцовпо сравнению со стандартными опреде-ляют степень модификационных изменений. 1 ил., 3 табл. дарствен тия восс о КцЬеп 85, ч. 38 Из уникальной структуры клейковины, оп"ределяющей технологические свойствапшеницы. Использование добавок впшеничную муку улучшает кацество хле"бопродуктов. Имеющиеся данные свидетельствуют о генетической специфицности модификации в процессе биосинтеза проламинов, что приводит к изменениям показателей, определяющихкачество зерна. В связи с этим разработаны различные способы определения модификационных изменений белкового комплекса зерновых культур,Известные способы включают экстракцию проламинов и определение содержания углеводов, суммарных липидов,гликолипидов или качественного состава липидной компоненты. Для опредея к еск биотехноим исслер, и может енки сорто" по качеству 30 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР(71) Днепропетровский госный университет им. 300-лдинения Украины с Россией(56) Патент СМА И 3679433кл, А 21 Л 3/14, 1972.Вв 1 Ь Л.А., КоВаап У.зсе 1 п Л. Р 1 ап Бсепсе, 1р. 93-98,Перуанский Ю.В., СавичАН КазССР, Сер, биол., 19с. 20-25. Изобретение относи логии, а именно генет дованиям зерновых кул быть использовано для образцов, различающих зерна. В процессе биосинтеза белки могут быть модифицированы сопутствующими небелковыми веществами (углеводы, липиды, гликолипиды). Процесс модификационных изменений затрагивает ос" новной компонент белкового комплек" са - проламин, который является маркером генома и выполняет запасную функцию в зерне, Вместе с тем и не- белковые вещества играют важную роль в Формировании. белковых структур, например, гликолипиды в Формировании Ь 1 Я 2ИЯ 2ОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИОДИФИКАЦИО ЕНЕНИИ БЕЛКО ОГО КОМПЛЕКСА 34 50 55 1739 дения генетической специфичности зер- новых культур к модификационным изменениям используют способ, согласно которому проводят 808-электрофорез или изоэлектрофокусирование камплек" са проламиновых белков в полиакриламидном геле. Электрофореграмму обрабатывают конкавалином А, меценым радиоактивным изотопом иода. Поспецифичности связывания отдельныхполипептидов с конкавалином А определяют зависимость процесса гликозилирования от исходного генотипа. К основным недостаткам указанных способов следует отнести трудоемкость и длительность операций по подготовке образца и проведение анализа с использованием набора дефицитных реагентов, которые специфицны для каждого определяемого компонента.Наиболее близким по техническойсущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ, включающий экстракцию проламиновых белков из зерна с различным генотипом, проведение электрофореза в полиакриламидном геле, окрашивание гелей цветореагентом и определение модификационных изменений белков по данным денситометрии.Согласно известному способу экст" рагируют проламин из селекционных образцов зерна раствором 70-ного этанола с 2)1 моцевиной. Затем проводят электрофоретическое разделение выделенных белковых препаратов в плоском 1 ОФ-ном полиакриламидном геле с 8 1 моцевиной в уксуснокислой системе, а также в 12,5-ном полиакриламидном геле с 0,1 додецилсульфата натрия в щелочных буферных растворах. После электрофореза гели окрашивают с помощью ШифФ-иодной кислоты для выявления углеводов, используя 12 операций в такой последовательности: обработка 100 мл 103 раствора трихлоруксусной кислоты в течение 30 мин; промывка дистиллированной водой по 200 мл (2 раза по 30 мин); обработка 100 мл 1,1-ного раствора исдной кислоты, приготовленной на 403-ном этаноле, в. течение 30 мин; промывка дистиллированной водой (2 раза по 200 мл в течение 5 мин выдержка в течение 4 мин в 100 мл восстанавливающего раствора (40 мл 53-ного раствора иодистого калия, 3растворенного в 5 Ф-ном растворе гипо-5 1 О 15 20 30 35 сульфита натрия и б 0 мл 3,5 мИ раствора соляной кислоты); повторная обработка в 100 мл свежеприготовленно- " го восстанавливающего раствора в течение 7 мин; обработка дистиллированной водой 3 раза; инкубирование. в 100 мл реактива ШифФа р течение 90 мин; ооработка 200 мл обесцвеци" вающего раствора (0,2 ь метабисульфита натрия, 403 этанола и 5 В уксусной кислоты) в течение 90 мин при 55 0; промывка (2 раза по 100 мл) раствором, содержащим 403 .этанола и 53 уксусной кислоты, в течение 30 мин обработка 200 мл 0,8-ного раствора метабисульфита натрия, приготовленного на 0,12 И соляной кислоте, до полного обеспечивания фона; Фиксирование в 53-ном растворе уксуснойкислоты.Оптическую плотность окрашенных зон полуцают путем сканирования гелей на денситометре и по .полученным значениям определяют модификационные изменения белкового комплекса зерна.Указанный способ сложен в техническом исполнении, отличается длительными и трудоемкими методиками, требует большого расхода дефицитных реагентов (более 10) и предусматривает подготовку сложных растворов (более 10) . К недостаткам способа следует также отнести и необходимость прове" дения электрофоретицеского разделе" ния комплекса проламиновых белков на группы полипептидов перед определением оптических параметров. Указанные недостатки ограничивают использование способа в селекционной практике для экспресс-диагностики.Цель изобретения - упрощение и ускорение анализа.Способ осуществляют следующим образом.Экстрагируют белки проламиновогокомплекса из размолотого зерна стан"дартного и исследуемого сортообразца злаковых культур. Проводят под"готовку препарата проламинг к анализу путем отливки пленки из раствора .на оптическое стекло. Измеряют инфракрасный спектр проламина на спектро"Фотометре в области 1550-1850 смопределяют значения оптической плотности в максимумах поглоц.ния при1710-1730 и 1 б 50-1660 см и рассциты"вают соотношение оптических плотностей при указанных максимумах в каче7392 стве сравнительного показателя. Повы"шение степени модибикации белкового комплекса:выявляют по возрастанию величины сравнительного показателя5 исследуемого сортообразца в сравнении со стандартным. Интервал знацений волновых чисел максимумов погло; щения при 1710-730 и 1650"1660 см обоснован экспериментально. ..1 ОНа .цертеже .приведены спектры погло" щения зерна Стандартного (линия кукурузы М 64 А +/+." кривая 1) и исследуемого (мутантная линия кукурузы . 164 А 02/02 " кривая 2) сортообразцов. 15Отличительными особенностями способа являются анализ по спектру поглощения проламина и определение сте-, пени модификационных изменений белкового комплекса зерна по величине от ношения оптических плотностей в максимумах поглощения проламина исследуемого сортообразца в сравнении со стандартным.П р и м е р . Исследуют ИК-спект- .25 .ры .глиадинов, выделенных экстракцией 703-ным этанолом после отделения во" до- и солерастворимых белков из размолотого зерна сортов пшеницы, контрастных по технологическим свойствам- Коралл Одесский (твердая) и Днепро" петровская-.846 (мягкая). Для подготовки тонкой пленки образца к анализу раствор 3 мг преларата в 0,5 мл 70 о-ного водного диоксана наносят на оптическое стекло из флюорита и высу" шивают под вакуумом. ИК-спектры глиадинов получают на приборе "Спекорд И". в области 550-850 смОпти- ческиеплотности О, и Оа в максимумах поглощения при ), и Я рассциты" 40 вают по методу базисной линии.Значения сравнительного показателя Э/Р глиадинов приведены в табл, 1 (данные статистически досто-верны,. ошибка. измерения не более 5;).Значения сравнительного показа-" теля свидетельствуют о возрастании модификационных изменений белков ,проламинового комплекса зерна пшени50 цы мягких сортов в сравнении с сор" тообразцом твердых пшениц.П р и м е р 2. Исследуют ИК-спектры проламинов, выделенных из зерна злаковых культур, аналогично примеруРезультаты определения сравнитель" ного показателя 0/Ва проламинов приведены в табл. 2 (данные стати-. 84, 6стически достоверны, ошибка измерения не более 5 Ф). Вариабельность сравнительного по"казателя свидетельствует о зависимос"ти степени модификационной изменчиво" ., сти проламинового комплекса от приро" ды зерн вых культур.П р и м е р 3. Исследуют аналогич,но примеру 1 ИК-спектры белков зеи" нового комплекса, выделенных из зерна кукурузы с различным генотипом путем экстракции раствором 704-ного этанола с /3-меркаптоэтанолом, В ка" цестве стандарта используют исходные линии кукурузы б 64 А +/+, А 619 +/+), а в качестве исследуемых образцов- линии кукурузы с эндоспермовыми му- . тациями типа о 2, за 2, о 2/о 2, вц 2/. Результаты .определения сравнительного показателя О,/0 зеинов приведены в табл. 3 (данные статистически достоверны, ошибка измерения не бо" лее 5 Ф). Полученные результаты подтверждают, цто сравнительный. критерий позволяет определить степень модифика" ционных изменений белкового комплекса в зависимости от типа эндоспермовой мутации,Так, мутация типа о 2/о 2 вызывает существенные изменения в процессах: модификации белков в отличие от мутации типа зц 2/яц 2. В двойных мута" циях типа о 2/о 2 зи 2/вц 2 наблюдается снижение модификационных изменений в сравнении с мутацией типа о 2/о 2.. Использование предполагаемого способа в сравнении с .известным по" зволит ускорить и упростить определе" ние модификационных изменений белкового комплекса зерна путем исключения длительных и трудоемких опера" ций, исклюцить расход многочисленных реагентов. Предлагаемый. способ позволяет выявить сортовую и генотипическую специфичность злаковых культур к модификационным изменениям белкового комплекса при оценке качества зерна по хозяйственно ценным призна-,. кам. Формула изобретения Способ определения модификационных изменений белкового комплексазерна, включающий экстракцию пролаСорт пшеницыи Коралл ОдесскийДнепровская.846 1730 . 1656 0,10 1730 1656 .0,21 Таблица 2 тетиитететеаааиттиивиеттае иееее иаеХарактеристика проламинов Осм ч,см 0 Вев и еа иСекалин (Рожь Харьковс"кая 55) 1720 Проламин тритикале (Амфиедиплоид 3/5) 1710 Авенин (Овес Скакун) 1730 Кафирин (Сорго Судзерн 62) ,1712 1660 0,23 1660 0,34 1650 0,39 1656 0,51 Т а б л и ц а 3е т аиеесм , см П/О Генотип кукурузы 7 17 мина исследуемых и стандартных сортообразцов злаковых культур и опреде ление модификационных изменений белка по оптическому параметру, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с це:лью упрощения и ускорения анализа, в качестве оптического параметра исследуют инфракрасный спектр прола" мина в области 15501850 смопреде" ляют значения оптических плотностей и 64 А +/+У 64 А о 2/о 2И 64 А вц 2/вц 2И 64 А о 2/о 2 вц 2/вц 2А 619 +/+А 619 о 2/о 2А 619 вц 2/вц 2А 619 о 2/о 2 вц 2/вц 2 в,максимумах, находят отношение значения оптической плотности а максимуме при 17101730 см" к значению оптической плотности в максимуме при16501660 см"1 и по возрастанию данного отношения у исследуемых сортооб" разцов по сравнению со стандартными . выявляют повышение степени модификационных изменений.1 1725 1656 0 21 1724 1656 0,40 1725 . 1656 . 0,12 1725 1656 0,13 17201656 0,22 1720 1656 0,30 1720 1656 0,19 1730 1656 0,16Составитель В.ФеденкоРедактор А.Козориз Техред А,Кравчук Коррект Лекмар з 199 ра писное ВНИИПИ ГКНТ СССР оиэводственно-иэдательский комбинат фПатент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 Государственного коми13035, Кос тета по иэва, 3-35,брете аушск ям и открытиям наб д, 4/5