Способ выделения липидов

(5 ЕТЕНИ ооду,11 р 1 бз. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗО К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт микробиологии АН СССР иНаучно-производственное обьединение(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения липидов,Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения липидов, стимулирующих биосинтез экзоферментов, из влажной биомассы микромицетов - основного отхода микробиологических произВодтсв,Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение свойств получаемого продукта.Для этого влажную биомассу (75-90) мицелиальных грибов, например, рода Азрегд 111 цз и представителей рода ТГ 1 сйосегаа обрабатывают 0,3-3-ным раствором уксусной кислоты при соотношении биомасса: раствор 1:2, Обработку проводят в течение 10-75 мин при интенсивном перемешивании и температуре 10-45 С. Далее водную фазу декантируют, а биомассу дважды промывают водой с последующей декантацией водной фазы; к влажной биомассе добавляют этанол, содержащий 0,1-5 тринатрийфосфата; соотношение влажная биоЖ 1693055 А стимулирующих биосинтез экзоферментов. Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение свойств получаемого продукта. Предложен способ получения лидидов из влажной биомассы микромицетов путем ее последовательной обработки 0,3- Зф,-ным раствором уксусной кислоты и этанолом, содержащим 0,1-5 тринатрий фосфата, Полученную водно-липидную эмульсию экстрагируют гексаном или смесью гексан, - вора, Выход липидов 6,4- 8,0";ь от сухой биомассы грибов. Полученные липиды используют как стимуляторы биосинтеза целлобиазы и пеногасители. 3 з,п. ф-лы, 3 табл. масса: экстрагент 1:3 (масса:масса), экстракцию проводят при интенсивном механическом перемешивании в течение 40-120 мин и температуре 20-45 С. Далее жидкую фазу Декантируют, а биомассу повторно экстрагируют при тех же условиях, что и для первой ступени экстракции, После декантации экстракты объединяют и концентрируют выпариванием на роторном испарителе до начала вспенивания остатка, Регенерированный этанол составляет 70 от обьема экстрагента и используется при дальнейшей экстракции,К полученной после концентрирования водно-липидной эмульсии добавляют гексан или смесь гексан:вода в соотношении 3:1 (объем:объем) при соотношении эмульсия:смесь 1:3. Далее смесь интенсивно перемешивают в течение 5-45 мин. После окончания перемешивания происходит расслоение жидкой фазы. Верхний слой (гексановая фракция) отбирают и сушат над10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 безводным сульфатом натрия в течение 15- 25 мин. После фильтрации через фильтр раствор концентрируют упариванием на роторном испарителе. Общий выход липидов составляет 6,4-8,0 от абсолютно сухой биомассы, Общее время, затраченное нэ выделение липидов, составляет 5-6 ч, Полученные липиды в концентрации 0,01-0,54 от объема питательной среды используют как добавки по двойному назначению. Вопервых, в качестве пеногасителя взамен дефицитных животных жиров (кашалотовый жир) или дорогостоящих синтетических пеногасителей (пропинол Б). Во-вторых, при добавлении липидов в питательную среду целлобиазная активность составляет 18,6-19,9 ед/мл, т.е, при значении активности 19, 8 ед/мл в 1,6 раза больше контрольных значений. Данные приведены в табл, 1.Полученные по предлагаемому способу липиды обладают следующими характеристиками.Внешний вид; подвижное, полупрозрачное масло темно-желтого цвета, Запах: напоминает запах зоастительного масла. Плотность 0,98 г/см . Токсичность; не изучена. Пожаровзрывоопасность: безопасен,Количественный анализ нейтральных липидов в экстрактах, полученных по предлагаемому способу и методом Фолча, проводят методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с последующей сканирующей денситометрией. ТСХ проводят на пластинках с силикагелем фирмы Мерк (ФРГ), Для разделения используют систему гексэндиэтиловый эфир: уксусная кислота (80;20;1). Идентификацию зон на хроматограммах проводят, используя стандарты и литературные данные, Сканирующую денситометрию проводят на приборе фирмы "Камак" (Франция), Полученные денситограммы обсчитывают, используя метод вырезания- взвешивания. Результаты количественного анализа представлены в табл. 2,Количественный анализ жирных кислот из липидов, полученных по предлагаемому и известному способам, проводили методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Условия проведения анализа: ГЖХ проводили на хроматографе "Хром" (ЧССР) на колонке,с 50 ь жидкой фазой Силар 5 ЦП, Параметры колонки 2500 х 3 мм. Режим разделения - изометрический, Температуры; колонка 180 С, инжектор 210 С, детектор 250 С. Газ-носитель - азот, скорость газа 40 мл/мин. Детектирование - плазменно-ионизационное. Метиловые эфиры жирных кислот получают из суммарных липидов и использованием кислого метанолиза.при 80 С в течение 6 ч с последующей экстракцией гексаном. Идентификацию пиков на хроматограммах проводили, используя стандартные образцы метиловых эфиров жирных кислот от С 16:0 до С 20:О. Количественный анализ проводили методом триангуляции с последующей статистической обработкой при и = 6. Результаты количественного анализа жирных кислот в экстрактах, полученных поизвестному и предлагаемому способам, представлены в табл. 3.П р и м е р 1. 200 г влажной биомассы микромицета Азрегд 111 цз 1 ароп 1 соз ВКМГ обрабатывают 1,2-ным водным раствором СНзСООН при соотношении биомассы:раствора 1;2 в течение 45 мин при интенсивном перемешивании и температуре 30 С, Далее водную фазу декантируют, а к биомассе добавляют этанол, содержащий 2,8 тринатрийфосфата (йазР 04), Соотношение влажная биомасса:экстрагент 1:3 (масса;масса). Экстракцию проводят в течение 80 мин при механическом перемешивании и температуре 30 С. Далее жидкую фазу декантируют, а биомассу повторно экстрагируют тем же количеством экстрагента при идентичных условиях. После объединения экстрактов проводят их концентрирование выпариванием на роторном испарителе до получения устойчивой водно-липидной эмульсии.К эмульсии добавляют смесь гексан:вода 3:1 (объем:объем) при соотношении эмульсия;смесь 1:3. Далее проводят перемешивание при 1000 об/мин в течение 30 мин. После окончания перемешивания и расслоения смеси верхнюю фазу отбирают. Нижнюю фазу повторно обрабатывают смесью гексан:вода при тех же условиях, Объединенную верхнюю фазу сушат над безводным сульфатом натрия, затем фильтруют через вату и концентрируют выпариванием на роторном испарителе до постоянного веса твердого остатка, Полученные липиды представляют собой темно-желтое гомогенноеомасло. Общий выход липидов 7,8 ь от весаабсолютно сухой биомассы,Полученные липиды добавляют в питательную среду в концентрации 0,1 об.ф, до стерилизации. В контрольном опыте продуцент целлобиазы (целлюлолитического экзофермента) выращивают нэ регламентной среде с добавлением липидов, полученных по известному способу. В другом контрольном опыте в питательную среду липиды не вносят. Культивирование микромицета, А.)ароп 1 свв проводят на круговой качалке при 200 ф 20 об/мин и 28 С в колбах емкостью 0,7 л с загрузкой по 100 мл питательной среды, Стерилизацию среды проводят при 1 атм втечение 0,5 ч при 0 С, Культивированиемикромицета осуществляют в течение 7 сут,далее культуральную жидкость отделяютцентрифугированием при 6000 об/мин и исследуют на активность целлобиазы, 5При добавлении липидов, полученныхпредлагаемым способом, целлобиаэная активность увеличивается в 1,6 раза по сравнению с контролем (внесение липидов,полученных по известному способу) и составляет 19,8 ед/мл.П р и м е р 2. Осуществляют процесссогласно примеру 1, но влажную биомассуобрабатывают 0,5;-ным раствором уксусной кислоты при времени обработки 10 мин, 15Выход липидов 6,7;, активность целлобиазы 19,0 ед/мл.П р и м е р 3. Осуществляют процесссогласно примеру 1, но влажную биомассуобрабатывают 2,7;-ным раствором уксусной кислоты при времени обработки 75 мин.Выход липидов 6,6;, активность целлобиазы 18.9 ед/мл.П р и м е р 4. Осуществляют процесссогласно примеру 1, но влажную биомассу 25обрабатывают 0,3;-ным раствором уксусной кислоты при 10 С. Выход липидов 6,9,активность целлобиазы 18,8 ед/мл.П р и м е р 5. Осуществляют процесссогласно примеру 1, но влажную биомассу 30обрабатывают 3-ной уксусной кислотойпри 45 С. Выход липидов 6.8 ф, активностьцеллобиазы 18,9 ед/мл,П р и м е р 6. Осуществляют процесссогласно примеру 1, но экстракцию проводят в течение 40 мин этанолом, содержащим0,1 тринатрийфосфата. Выход липидов6,7, активность целлобиазы 19,0 ед/мл.П р и м е р 7. Осуществляют процесссогласно примеру 1, но экстракцию проводят этанолом, содержащим 5; тринатрийфосфата, в течение 120 мин. Выход липидов6,6;, активность целлобиазы 18,6 ед/мл.П р и.м е р 8. Осуществляют процесссогласно примеру 1, но водно-липидную 45эмульсию экстрагируют смесь гексан:вода втечение 45 мин. Выход липидов 6,7, а активность целлобиазы 18,8 ед/мл.П р и м е р 9, Осуществляют процесссогласно примеру 1, но экстракцию воднолипидной эмульсии гексаном проводят 5мин. Выход липидов 6,5, активность целлобиазы 19,2 ед/мл. П р и м е р 10. Осуществляют процесс 55согласно примеру 1, но в качестве источникаполучения липидов используют влажнуюбиомассу мицелиального гриба Тгсйобегаачгчае ВКПМ/10, Выход липидов 7,0,целлобиазная активность 19,4 ед/мл,П р и м е р 11, Осуществляют процесс согласно примеру 1, используют биомассу продуцента пектиназы Аэрегцця 1 ос 6 соз М. Выход липидов 7,5%, целлобиаэная активность 19,6 ед/мл.П р и м е р 12, Согласно примеру 1, но обработку влажной биомассы проводят в течение 5 мин 0,2;-ной уксусной кислотой, Выход лицидов 4,2, активность целлобиазы 13.5 ед/мл,П р и м е р 13, Согласно примеру 1, но обработку влажной биомассы проводят в течение 80 мин 4 ь-ной уксусной кислотой при 50 С. Выход липидов 2,9, активность целлобиазы 12,8 ед/мл.П р и м е р 14. Согласно примеру 10, но экстракцию липидов проводят этанолом, содержащим 6,5 тринатрийфосфата, в течение 130 мин. Выход липидов 3,5;, активность целлобиазы 12, 5 ед/мл.П р и м е р 15, Согласно примеру 10, но экстракцию водно-липидной эмульсии проводят гексаном в течение 3 мин и полученные липиды добавляют в количестве 1.Выход полученных липидов 4,8, активность14, 3 ед/мл;Таким образом, предлагаемый способ позволяет экстрагировать липиды из влажной биомассы микромицетов, являющейся отходом целевых ферментных производств, Преимущества способа состоят в том, что для экстракции используются дешевые малотоксичные и неканцерогенные раствори- тели и реактивы, сокращается время процесса получения липидов (с 7-8 до 5-6 ч). Регенерация растворителей делает способ экологически более чистым и более экономичным, Полученные липиды отличаются по составу нейтральных липидов от продукта, полученного известным способом, а именно содержат больше триглицеридов, свободных жирных кислот, меньше стеринов и особенно их эфиров. Высокое содержание ненасыщенных триглицеридов позволяет испольэовать полученные липиды в качестве пеногасителей.Основные отличия в составе жирных кислот липидов, полученных по предлагаемому и известному способам, состоят в следующем (табл. 3).Липиды, полученные предлагаемым способом, содержат в 1,1 раза меньше ненасыщенных кислот, чем липиды, полученные по известному способу, Однако при экстракции по предлагаемому способу содержание линоленовой кислоты в липидах в 2,06 раза выше, чем в липидах, полученных по известному способу. Высокое содержание линоленовой кислоты обусловливает высокую ценность полученных липидов с1693055 Таблица 1 Ва иант опыта 12,4+0,3 12.1 +0,3 30 Табл и ца 2 точки зрения получения" из них препарата витамина (незаменимых жирных кислот).Применение липидов, полученных по предлагаемому способу, в качестве стимуляторов биосинтеза целлобиаэы при их до бавлении в питательные среды позволяют производить дополнительно минимально 20-30 т продукции.Преимущество предлагаемого способа, состоит также в том, что липиды экстрагиру ют из влажной, а не предварительно высушенной биомассы (промышленный способ экстракции). Такое решение приводит к существенной экономии энергии, расходуемой в процессе сушки, кроме того, 15 позволяет избежать окисления липидов и сохранить их полезные свойства.ф омула изобретения1, Способ выделения липидов из биомассы микромицетов - продуцентов экзо гидролаз, включающий экстракцию органическими растворителями, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения свойств получаемого продукта, биомассу предва рительно обрабатывают О,З-Зф -ным рас-Липиды, полученные экстракцией этанолом и гексаном(предлагаемый способ) Липиды, полученные по известному способу(ко нтрол ь ) Опыт без добавления липидов (контроль 1)твором уксусной кислоты при 10-45 С в течение 10-75 мин, экстракцию проводят дважды в течение 40-120 мин с использованием в качестве экстрагента этанола,.содержащего 0,1-56 тринатрийфосфата, экстракты обьединяют, концентрируют выпариванием, а остаток в виде водно-липидной эмульсии дважды экстрагируют в течение 5-45 мин гексаном или смесью гексан-вода, после расслоения смеси отбирают липидсодержащие фракции, объединяют их, сушат и концентрируют.2. Способ по и. 1, отл и чаю щи й с я тем, что при экстракции водно-липидной эмульсии используют смесь гексан-вода при соотношении компонентов соответственно 3:1.3. Способ поп.1, отл ич а ю щи йся тем, что экстракцию этанолом проводят при массовом соотношении биомасса:этанол 1:3.4, Способ по и. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что экстракцию водно-липидной эмульсии гексаном или смесью гексан-вода осуществляют при использовании их в трехкратном объеме по отношению к объему водно-липидной эмульсии. еллобиазная активность, е /мл 19,8+0,21 б 93055Таблица 3Составитель, О.СкородумоваРедактор О.Юрковецкая Техред М.Моргентал Корректор Т.МалецЗаказ 4051 Тираж Подписное8 НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-.издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101