Способ определения жизнеспособности эмбрионов лабораторных мышей

СОГОЗ СОНЕТ СКИХСОЦИАЛИСТИЧГСКИХРЕСПУБЛИК 1 еФо ча 1 го ев, 19 ЖИЗН ЕСПО- ЛАБОРАТОР 00 ется повыше- ение способа, ледующим обГОСУДАРСТБЕННЦИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЬ ТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯСОБНОСТИ ЭМБРИОНОВНЫХ МЫШЕЙ(57) Изобретение относится к способам определения физиологического состояния биологических объектов и может бытьприменено в биотехнологии, животноводчестве, эмбриологии, Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение Изобретение относится к способам определения физиологического состояния биологических обьектов и может быть применено в биотехнологии, животноводстве, эмбриологии,Целью изобретения являние чувствительности и ускорСпособ осуществляется сразом.Берут морфологически одинаковые нормальные эмбрионы мышей в их естественной целостности, помещают в среду следующего состава: глюкоза 4,9 - 5,1 мас.,ь. остальное - деионизованная вода с кондуктивностью, доведенной до 20 - 30,и Я сбалансированным солевым раствором 5 Ц 1 б 88848 А 1(51)5 А 61 В 10/00, С 12 М 3/ОО способа. Цель достигается тем, что эмбрионы лабораторных мышей и маркер-сефадексовую гранулу 6-100 аале помещают на стартовую позицию в камере для электрофореза, заполненной питательной средой, состоящей из глюкозы концентрации 4,9 - 5,1 и раствора Дульбекко-Фогт с кондуктивностью 20 - 30,и Я, Через камеру пропускают электрический ток с градиентом потенциала 5 - 15 В/см и регистрируют под микроскопом в потоке электроосмоса вектор и величину скорости эмбрионов по отношению к таковым маркера, Полученную величину скорости эмбрионов подставляют в формулу, связывающую скорость эмбрионов (Ч) с их жизнеспособностью (Р), и получают 0 выживаемо- Б сти у протестированной группы эмбрионов Р, ь= 10,337+ 18,970Ч - 1,107 Ч . 1 табл. Дульбекко-фогт, взятым в необходимых для данной кондуктивности количествах, Раствор Дульбекко-фогт, мас.ф,: йаС 0,8; КС 0,02; СаС 2 0,01; МдС 26 Н 20 0,01; КНгРО 4 0,02; ча 2 НРО 4Н 20 1,42; вода деионизованная - остальное, рН 6,8. Через среду с эмбрионами в камере для электрофореза с неполя ризующимися Ад/Ад С электродами пропускают электрический ток с градиентом потенциала 5 - 15 В/см и регистрируют скорость движения эмбриона в потоке электроосмоса на дне камеры, О жизнеспособности судят, сравнивая скорость и вектор движения эмбриона с тактовыми маркера, в качестве которого берут полимерную сферическую гранулу сефадекса 6 - 100 йпе, которая по своим параметрам близка к параметрам эмбриона и (например, эмбриона мыши) и, как эмбрион, имеет отрицательную плавучесть, форму и размеры, аналогичные эмбриону, а в отличие от эмбриона имеет электрически нейтральную поверхность и способность двигаться в электрическом поле в строгом соответствии с вектором и скоростью потока электроосмоса.Для определения жизнеспособности эмбрионов мышей предлагается эмпирическая формула, отражающая зависимость между скоростью движения эмбрионов и их жизнеспособностью:Р, О=10,337 +18,970 Ч - 1,107Ч, (1) где Р - величина жизнеспособности эмбрионов, указывающая процент выживаемости у эмбрионов, имеющих данную скорость;Ч - скорость в потоке электроосмоса у тестированного эмбриона с учетом скорости и вектора движения маркера, (мкм/с)/тотальности эмбрионов, что неприемлемо при определении их жизнеспособности,П р и м е р 2. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных белых мышей ЗНК на стадии двух бластомеров в количестве 10 штук. Помещают их с маркером - сефадексовой гранулой диаметром 80 мкм,подобранным под соедний размер эмбрионов, на одинаковую стартовую позицию на 10 дне злектрофоретической камеры со средой, состоящей из 5,0 мас.;6 глюкозы, остальное - деионизованная вода с Дул ьбекко-Фогт, пропускают электрический ток с градиентом потенциала 2 В/см, наблюдают движение маркера к катоду и начало проявления собственной электрокинетической подвижности к аноду у некоторых эмбрионов с сохранением исходных морфологических признаков у всех эмбрио 20 кондуктивностью, доведенной до 25 ,и 315 сбалансированным солевым раствором(В/см);- коэффициенты, подобранные ЗВМ на основе прямого анализа связи жизнеспособности с величиной скорости у тотальных эмбрионов, принятых в.качестве стандарта.П р и м е р. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных мышей БНК на стадии двух бластомеров в количестве 10 штук. Помещают их с маркером - сефадексовой гранулой 6 - 100 Ппе, диаметром 80 мкм, подобранным под средний диаметр эмбрионов, на одинаковую стартовую позицию на дно электрофоретической камеры со средой, состоящей из 5,0 мас/ глюкозы, остальное - детонизованная вода с кондуктивностью, доведенной непосредственно по кондуктомеру до 10,и Я сбалансированным солевым раствором Дульбекко-Фогт, взятым в необходимом для данной кондуктивности количестве, пропускают электрический ток с градиентом потенциала 2 В/см (измеряемым непосредственно в камере с помощью серебряных электродов) в течение 1 мин, наблюдают движение маркера к катоду и отсутствие собственной электрокинетической подвижности эмбрионов,Повышают градиент потенциала до 10 В/см, наблюдают движение маркера и отсутствие собственной электрокинетической подвижности эмбрионов,Повышают градиент потенциала до 20 В/см, наблюдаютдвижение маркера к катоду и проявление собственной электрокинетической подвижности - у 60 оь эмбрионов к аноду, однако 40 эмбрионов за время измерения теряют исходные морфологические признаки, т, е, г 1 роисходит нарушение 25 30 35 40 45 50 нов.Делают заключение, что данное сочетание числовых значений параметров обладает недостаточной разрешающей способностью, так как электрокинетическую подвижность проявляют только некоторые единичные эмбрионы,Повышают градиент потенциала до 10 В/см, наблюдают движение маркера к катоду и проявление собственной электрокинетической подвижности у 80 % эмбрионов к аноду при сохранении исходных морфологических признаков у 100; эмбрионов, Делают вывод о том, что данное сочетание числовых величин является приемлемым, так как у всех эмбрионов не утрачиваются исходные морфологические признаки, и они проявляют активную собственную электро- кинетическую подвижность, Далее повышают градиент потенциала до 20 В/см, наблюдают движение маркера к катоду и проявление собственной электрокинетической подвижности у 90 О/ эмбрионов к аноду, однако у 50% эмбрионов утрачиваются исходные морфологические признаки, т, е. происходит нарушение тотальности эмбрионов, что неприемлемо при определении их жизнеспособности,П р и м е р 3. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных мышей ЯНК на стадии двух бластомеров в количестве 9 штук, Помещают их с маркером - сефадексовой гранулой диаметром 80 мкм (подобоанной в соответствии с диаметром тестируемых эмбрионов) на одинаковую стартовую позицию на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей из 5,05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мас. глюкозы, остальное в деионизованн вода с кондуктивностью, доведенной по кондуктометру до 50,и Я сбалансированным солевым раствором Дульбекко-Фогт, пропускают электрический ток с градиентом потенциала 2 В/см, наблюдают движение маркера к катоду и начало проявления электрокинетической подвижности к аноду у некоторых эмбрионов без изменения исходных морфологических признаков у всех эмбрионов. Повышают градиент потенциала до 10 В/см, наблюдают движение маркера к катоду и проявление собственной электрокинетической подвижности у 77,8 эмбрионов к аноду, однако 44,5 эмбрионов в процессе измерения теряют исходные морфологические признаки, т. е, происходит нарушение тотальности эмбрионов, что неприемлемо при определении их жизнеспособности.П р и м е р 4. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных мышей ЯНК и линейных мышей С 57 ВУ 6) на стадии двух бластомеров в количестве 10 штук в случайном сочетании, Помещают поочередно их и маркер - сефадексовую гранулу диаметром 80 мкм на одинаковую стартовую позицию на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей из 4,8 мас.оь глюкозы, остальное - деионизованная вода, с кондуктивностью, доведенной до 10,иЯ сбалансированным сопевым раствором Дульбекко-Фогт, взятым в необходимом для данной кондуктивности количестве, пропускают электрический ток с градиентом потенциала 2 В/см в течение 1 мин. Наблюдают в микроскоп отсутствие собственной электрокинетической подвижности у всех эмбрионов и пассивный.их перенос потоком электроосмоса в сторону катода со скоростью и вектором маркера. Вычисление собственной электрокинетической скорости эмбрионов невозможно.П р и м е р 5. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных мышей ЯНК и линейных мышей С 57 ВУ 6) на стадии двух бластомеров в количестве 10 штук в случайном сочетании. Помещают поочередно их и маркер - сефадексовую гранулу диаметром 80 мкм на одинаковую стартовую позицию на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей из 5,2 мас. глюкозы, остальное - деионизованная вода с кондуктивностью, доведенной до 35 рЯ сбалансированным солевым раствором Дульбекко-Фогг, взятым в необходимомдля данной кондуктивности количестве, пропускают электрический ток с градиентом потенциала 20 В/см в течение 1 мин, наблюдают проявление эпектрокинетической подвижности у эмбрионов, однако 50;4 из них за время измерения их скорости теряют исходные морфологические признаки, т, е.происходит нарушение тотальности эмбрионов, что неприемлемо при определении их жизнеспособности.П р и м е р 6. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с блестящей оболочкой от беспородных мышей ЯНК на стадии двух бластомеров в количестве 12 штук, Помещают их поочередно с маркером - сефадексовой гранулой 6 - 100 йпе диаметром 80 мкм (т. е, равным среднему диаметру эмбрионов) на одинаковую позицию на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей иэ 4,9 мас.глюкозы, остальное - деионизованная вода с кондуктивностью, доведенной до 20 р Я сбалансированным солевым раствором Дупьбекко-Фогт, взятым в необходимом для данной кондуктивности количестве, пропускают постоянный электрический ток с градиентом потенциала 5 В/см (измеряемым непосредственно в камере с помощью серебряных электродов) в течение 0,6 мин, как времени, достаточного для одновременного перемещения эмбриона и маркера на расстояние в несколько собственных диаметров, и по окулярмикрометру микроскопа отмечают вектор и измеряют путь, пройденные за это время эмбрионов и маркером, На основе этого вычисляют величину скорости эмбриона по отношению к маркеру и получают: 5 эмбрионов имеют среднюю скорость 2 +0,3 (мкм/с)/(В/см), подставляют среднее значение их скорости в формулу(1), получают ожидаемую выживаемость43,%ф; 7 эмбрионов имеют среднюю скорость 4,5 +1,1 (мкм/с)/(В/см), подставляют среднее значение их скорости в формулу(1), получают ожидаемую выживаемость 73,29.Проверяют жизнеспособность данных групп эмбрионов раздельным культивированием в стандартных условиях (по методу Виттена) в течение 74 ч, получают развитиедо стадии бластоцисты соответственно 40 и 71,4.П р и м е р 7, Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных мышей ЯНК илинейных мышей С 57 В 1/6) на стадии двух бпастомеров в количестве 42 штук в случай-. ном сочетании. Помещают поочередно их и маркер - сефадексовую гранупу диаметром 80 мкм на одинаковую стартовую позициюна дне электрофоретической камеры со средой, состоящей иэ 5,0 мас. глюкозы, остальное - деионизованная вода с кондуктивностью, доведенной до 25,и Я сбалансированным солевым раствором Дульбекко-фогт, взятым в необходимом для данной кондуктивности количестве, пропускают постоянный электрический ток с градиентом потенциала 10 В/см в течение 0,8 мин, как времени, достаточного для одновременного перемещения эмбриона и маркера на расстояние в несколько собственных диаметров, и по окулярмикрометру микроскопа отмечают вектор и измеряют путь, пройденный за это время эмбрионом и маркером, вычисляют величину скорости эмбриона по отношению к маркеру и получают: 22 эмбриона имеют среднюю скорость 9 +1,5 (мкм/с)/(В/см), подставляют среднее значение скорости в формулу (1), получают ожидаемую величину выживаемости 90,9%; 15 эмбрионов имеют среднюю скорость 5,5 + 1,9 (мкм/с)l(В/см), подставляют среднее значение скорости в формулу (1), получают ожидаемую выживаемость 81,19; 5 эмбрионов имеют среднюю 3 + 0,7 (мкм/с)/(В/см), подставляют среднее значение скорости в формулу(1), получают ожидаемую выживаемость 57,287 ь,Проверяют жизнеспособность данных групп эмбрионов раздельным культивированием в стандартных условиях в течение 74 ч, получают развитие в культуре соответственно 90,9; 73,3 и 60,П р и м е р 8, Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от линейных мышей С 57 ВУ 6) на стадии двух бластомеров в количестве 12 штук. Помещают их поочередно с маркером - сефадексовой гранулой диаметром 80 мкм на одинаковую стартовую позицию на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей из 5,1 мас,глюкозы, остальное - деионизованная вода с кондуктивностью, доведенной до 30 р Я сбалансированным солевым раствором Дульбекко-Фогт, взятым в необходимом для данной кондуктивности количестве, пропускают постоянный электрический ток с градиентом потенциала 15 В/см в течение 1 мин, как времени, достаточного для одновременного перемещения эмбриона и маркера на расстояние в10 30 35 40 45 50 даемую выживаемость 86,87, проверяютжизнеспособность данной группы эмбрионов культивированием в стандартных условиях в течение 74 ч, получают развитие до стадии бластоцисты 91,67.В таблице приведены данные о влиянии концентрации глюкозы в питательной среде на изменение исходных морфологических признаков эмбриона.Таким образом, понижение концентрации глюкозы ниже 4,9 оь и повышение сверх 5,1 О, приводит к изменению исходных морфологических признаков эмбрионов, что неприемлемо при определении их жизнеспособности,Способ позволяет снизить время на определение жизнеспособности эмбрионов до 0,6 - 1 мин и прогнозировать выживаемость эмбрионов до культивирования.Формула изобретения.Способ определения жизнеспособности эмбрионов лабораторных мышей по физиологическому параметру, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, в качестве физиологического параметра используют электрокинетическую подвижность эмбрионов и свойства маркера - сефадексовой гранулы в среде следующего состава: глюкоза 4,9 - 5,1 мас деионизированная вода, кондуктивность которой доведена до 20- 30 р Я сбалансированным солевым раствором Дульбекко-Фогт 100 мл, а жизнеспособность эмбрионов определяют по формулеР, = 10,337-18,970 Ч - 1,107 е Ч, огде Р - величина, указывающая процент выживаемости у эмбрионов, имеющих данную скорость;Ч - скорость в потоке электроосмоса у тестированного эмбриона с учетом скорости и вектора движения маркера, (мкм/с)/(В/см),несколько собственных диаметров, и по окулярмикрометру микроскопа отмечают вектор и измеряют путь, пройденный за это время эмбрионом и маркером, вычисляют5 величину скорости эмбриона по отношениюк маркеру, получают среднюю скорость для 12 эмбрионов, равную 6,5+1,5(мкм/с)/(В/см), подставляют среднее значение скорости из формулы (1), получают ожи1688848 10 При меч ан ие. "+ енение исходных морфологических признако Составитель М. Маляроваедактор И. Шманова Техред М.Моргентал Корректор С. Чер Производственно-издательский комоинатПатент", г. Ужгород, ул.Гагарина Заказ 3760 ВНИИПТираж Посударственного комитета по изобретениям 113035, Москва, Ж, Раушская.на писноеоткрытиям при ГКНТ ССС