Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis suвsр. кursтакi для получения энтомопатогенного препарата против lерidортеrа и соlеортеrа

3 А 01 М 63/ ГОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯПРИ ГКНТ СССР 1 ЛИТЕТОТКРЫТИЯМ ИСА ОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ Целыа изоЬретения является получение нового штамма Васцз тЬцгпдепзз зцЬзр,цгз 1 аа, обладающего инсектицидной активностью против представителей отрядоверОор 1 ега и Соеортега, Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Института "ВНИИгенетика" и имеет регистрационный номер ВКПМ - 4853, Штамм создан методом трансфекции на основе Васцз йцгпдепзз зцЬзр.кцгз 1 аИ НО - 1 "Оре", Донором плазмидной ДНК служил штамм ВасИцз йцгпдепзз зцЬзр.КцгзтаИ, Полученный штамм В,ТЬцгпдепзз зцЬзр,;цгзсаИ продуцирует д-эндотоксины, обладающие инсектицидной активностью против бабочек и жуков, вредителей сельскохозяйственных культур. Штамм продуцирует кристаллы д-зндотаксина трех типов. На среде ДПС продуктивность штамма 4,6 10" спор/мл, токсинообразование на среде "00 со" 0,3 мг/мл. Для непарного шелкопряда летальная концентрация токсических компонентов препарата, вызывающая 100-ю смертность, на 1 г корма равна 1,5 10 спор/мл и 8 мкг токсина/мл; для колорадского жука на 1 см листа картофеля - 2,5 10 спор/мл и 70 мкг токсина/мл.з4 табл ательский омышленрдский хитввн ного имический сследо кции и ССР, Бе изводс рм" и Х нов, И,А.Залунин,а, Р.П.Комарских,зо, А,А.Антонов,ина и В.М.Степату 279, кл, А 01(54) ШТАММ БАК ЕРИИ ВАСОЯ ТНОЮИОЕИЯЯ Я.ВЯР.КОВЯТАК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕН НОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВЕРООРТЕВА И СО ЕОРТЕЯА(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, может быть использовано в производстве препаратов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур и лесных насаждений и представляет собой новый штамм спорообразующих бактерий.еапй 00 ООаевЪ Изобретение относится к микробиолоической промышленности и биотехнолоии, может быть использовано в произодстве препаратов для борьбы с вредитеями сельскохозяйственных культур и лесых насэждый штаммЦельюовогоцЬзр.Ьгз ении и спорооб изобрете штамма аЮ, облф В,СОЮЗ СОВЕ ГСКИд(71) Всесоюзный научно-иинститут генетики и селеных микроорганизмов Смический завод Прообъединения "СиббиофазаводГрогресс"(56) Патент США М:- 47963/00, 1989,редставляет собой норазующих бактерий, ния является получениеВас,11 цгпдепзз дающего инсектицид 1688819мер стороны 1,1 мкм) 10 15 ной активностью против предсгавцг ел и отрядовер 1 с 3 орега и Со 1 еортега.Штамм получен путем скрещинанияштамма Васлбцг 1 п 91 епз 3 з зцЬзр.3 цгмаЬ НО -1 "О 3 ре 3" со штаммом Вас,сйцг п 91 епз 1 ззц Ьз рлепеЬг оп 1 з при совместном кул ьтивировании. Полученный штамм обладает ин-.сектицидной активностью против колорадского жука (отр.Со 3 еор 1 ега) и представителей отрядаер сортега, ШтаммВаслМг 3 п 9 епз 1 з зцЬзр,МгыаИ Т - 2 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Института"ВНИИ - генетика" и имеет регистрационный номер ВКПМ - В - 4853.Штамм характеризуется следующимипризнаками.Культурально-морфологические признаки, Грамположительные подвижные палочки размером 4,1 - 1,6 мкм. Встационарной фазе роста образуют кристаллы д-эндотоксинов и овальные споры,Хороцо растет на МП средах при 27 - 29 Си р Н 6,8 - 7,5. Н а М ПА на 10-е сутки и ри 29 Собразует однородные колонии 3 - 5 мм вдиаметре, светло-серого цвета со слабо изрезанным краем. Структура мелкозернистая.В МПБ рост умеренный, помутнение однородное, образует кольцеобразную пленку.На картофельном агаре и агаризованной среде Хоттингера рост обильный, на 7-есутки при 29 С колонии светло-серого цвета, однородные, пигмента не образуют. ПоН-антигену относится к сероварианту 333(ЗаЗв).Физиолого-биохимические признаки.Отношение к источникам углерода: усваивает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал,соевую и кукурузную муку. Не усваиваетлактозу, ксилозу, арабинозу, лецитин, Пептонизирует молоко, гидролизует крахмал,желатин не разжижает.Отношение к источникам азота; восстанавливает нитраты, усваивает аммонийныеформы азота,Отношение к температуре; хорошо растет при 27 - 29 С. оптимальная температураОтношение к рН среды; хорошо растетпри б 8 - 75, огпимум рН 7,2,Отношение к кислороду: аэроб.Отношение к фагам: устойчив к основным производственным фагам 11, 22, С/П,И - 77, 25 - 16,Энтомопатогенные свойства; синтезирует д-эндотоксины, обладающие инсекти 20 25 30 35 40 45 50 цидной активностью против представителей отрядаер 1 г 3 ор 1 ега и Со 3 еорсега, синтезирует кристаллы д-эндотоксинов трех типов. большой (1,1 х 0,7 мкм) и маленький(0,5 - 0,3 мкм) ромбы, плоский квадрат (разГенетические особенности: рекомбинантный штамм Вас,1 Ьцг 1 п 91 епз 1 з зцЬзр.1 цгзтаИ Т - 2 наряду с плазмидами, свойственными штамму Васлпцг 3 п 93 епз 1 з зцЬзр,Ьлгиа 33 НО - 1 "О 3 ре" (реципиент), посредством трансцепции приобретает плазмидную ДН К штамма Вас.1 Ьцгп 93 епз 3 з зцЬзрлепеЬгопз 3 з (донор) размером "60 т,п.н, Плазмида стабильна на протяжении более чем 100 генераций клеток. Стабильность штамма Т - 2 проверяют со- гласно следующей схеме, Штамм снимают петлей с агаризованной Мц 1 г 3 еп 1 Вгой (КВ) и вносят в 2 мл аналогичной питательной среды, после чего выращивают в течение 12 ч при 28 С на круговой качалке при 240 - 260 об,/мин. Затем 1 мл микробной культуры засевают в колбу емкостью 750 мл с обьемом среды выращивания 100 мл Мцтг 1 елт Вгой. По окончании 4-часового интервала 1/2 часть культуры отбирают и добавляют равный обьем свежей КВ-среды. Образцы отбирают для исследования культуральных признаков, иммунологического анализа и выделения плазмидной ДНК. Осуществляют 10 таких переносов, что составляет, согласно подсчетам, более 200 генераций клеток. Отобранные образцы разводят и высевают на чашки Петри с агаризованной средой Хоттингера с расчетом 30 - 100 колоний на чашку, после чего инкубируют при 28 С в течение 7 - 10 сут до полной споруляции анализированных клонов. Анализ плазмидного профиля, культуоально-морфологических признаков, иммунологических свойств не выявил нестабильные варианты,Предлагаемый рекомбинантный штамм Т - 2 генетически стабилен.Маркерные признаки; Н-антиген ЗаЗв, плаэмида размером 60 т,п.нштамм обладает инсектицидной активностью против представителей отрядов .ер 1 с 3 ор 1 ега и Со 3 еортега и образует три типа кристаллов д-эндотоксинов (большой и маленький ромб, плоский квадоат), /3-эндотоксин не синтезирует.Штамм хранят в ампулах после лилфилиэации спорокристаллической смеси обь чным способом или в агаризованной МПБ(донор, далее обозначается как ТЕК), а также предлагаемый новый рекомбинантныйштамм Вас.йцг 91 епз 1 з зцЬзр.1 сцгзсаИ Т - 2(далее обозначается как Т - 2) для подготовки посевного материала выращивают в 2 млМПБ в течение 12 ч при 28 С на,круговойкачалке при 240 - 260 об./мин. Затем 1 мл.микробной культуры засевают в колбы емкостью 750 мл с объемом среды выращивания 50 мл дрожже-полисахаридной среды(ДПС) следуюшего состава, г/л: дрожжи .кормовые 36; кукурузная мука 26,8; соеваямука 5,0; мел 3,0; вода - остальное, рН среды 7,2, и культивируют на круговой качалке 1548 ч до стадии полной споруляции в тех жеусловиях. Определение титра жизнеспособных спор проводят на чашках Петри с МПа.Результаты исследований приведены втабл.1, 20Данные сравнительного анализа, проведенного в лабораторных условиях, показывают, что продуктивность штамма Тнеуступает продуктивности исходных родительских штаммов и составляет 4,6 х 10 259спор/мл.П р и м е р 2. Иммунологический анализд-эндотоксинов родительских штаммов КОКи ТЕК и сконструированного штамма Т - 2проводят в реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони,Для этих целей исследуемые штаммывыращивают на питательной среде ("ОПсо",США) в колбах емкостью 750 мл в объемесреды выращивания 75 мл. Подготовку посевного материала и культивирование проводят, как в примере 1. После выращиванияисследуемых штаммов до стадии полнойспоруляции споры и кристаллы осаждаютцентрифугированием при скорости 6000 40об./мин 15 мин, трижды промываютдистиллированной водой и гомогенизируют в 80 млбуфера (0,005 М трис-НС 1, рН 8,0,с 0,5 твин - 80) 5 мин при скорости 5000 об./мин.Затем 20 мл суспензии наслаивают на поверхность 20 мл 67%-ного раствора верографина в пробирках емкостью 50 мл кротору 13 - 20 ("ВесМвап", США) и центрифугируют 90 мин при скорости 10000об,/мин и 4 С. Фракцию кристаллов, локализованную на границе интерфаз вода -верографин, отбирают с помощью пастеровской пипетки и отмывают от остатка верографина центрифугированием противдистиллированной воды трижды при 6000 55об./мин в течение 10 мин. Очищенные кристаллы (более 960 чистоты) растворяют в50 мл 0,05 М ИаО Н, р Н 12,5 и 37 С в течение 1 ч. Количество полученного д-зндотоксина оценивают спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Далее растворы кристаллов используют для иммунологического анализа с иммуноглобулинами кролика против д-эндотоксинов родительских штаммов КОК и ТЕМ в реакции Оухтерлони, Результаты исследований представлены в табл.2,Как показывают приведенные в табл.2 данные, д-зндотоксины исходных родительских штаммов резко отличаются между собой по своим иммунологическим свойствам, в то время как рекомбинантный штамм Т - 2 синтезирует кристаллические белки, иммунологически идентичные и штамму-донору, и штамму-реципиенту.Появление дополнительного д-эндотоксина штамма Т - 2 коррелирует с появлением плазмидной ДНК размером 60 т.п.н., присутствие которой наблюдали в плазмидном профиле после анализа плазмидной ДНК иоследуемых штаммов с помощью электрофореза в 0,6 -ном агарозном геле. Анализ и выделение плазмидной ДНК проводят с помощью метода ВгпЬоа,Суммарная продукция д-эндотоксиноо у штамма Т - 2 не отличается от продукции на указанной среде выращивания от исходных родительских штаммов и составляет 0,3 мг/мл.Долю эндотоксинов, специфичных для 1 ерЫортега и Соеор 1 ега, определяют с помощью ЯОЗ-электрофореза в 7/, ПААГ по методу И/еЬег и ОзЬогп. Для этих целей штаммы подращивают и получают растворы эндотоксинов, как в примере 2,Результаты электрофоретического анализа приведены в табл,3.Белки с молекулярной массой 133, 130 и 65 кДа обладают инсектицидной активностью против представителей отрядаер 1- бортега. По данным электрофореза эга группа белков составляет примерно 70% от общего количества белков эндотоксинов рекомбинантного штамма Т - 2, Остальная доля общего белка приходится на эндотоксин с мол. массой 70 кДа, обладающий инсектицидной активностью против колорадского жука.В полях зрения электронного микроскопа обнаружено у штамма Т - 2 три типа кристаллов. Два из них свойственны штамму КОК (большой и маленький ромб), а третий тип кристаллического. включения (плоский квадрат) свойствен штамму ТЕМП р и м е р 3. Определение энтомоцидной активности д-эндотоксинов сконструированного и родительских штаммов проводят на личинках непарного шелкопря 1688819да (1 1 еап 1 г 1 а б 1 зраг), используемого в качестве тест-объекта энтомоцидных свойств средств защиты растений, а также на личинках колорадского жука (1 ерОпо 1 агза бесеаПпеаса Яау) - . основного вредителя семейства пасленовых и представителя отряда Соеорсега.Штаммы выращиваютдо стадии полной споруляции, как в примере 2, Используют гусениц непарного шелкопряда 2 - 3 возрастов. Тест-насекомых содержат в чашках Петри при 25 - 28 С и влажности 70-90, фотопериод 18 ч. В каждом опыте используют 45 гусениц. Гусеницам дают возможность свободно поглощать инфицированный искусственный корм (3 г на чашку). Учет гибели гусениц проводят на 6-е сутки, Биотестирование на личинках колорадского жука проводят по следующей схеме. Личинки 1 - 2 возраста помещают в чашки Петри на лист картофеля. Листовые пластинки обрабатывают суспензией спор и кристаллов исследуемых штаммов до полного смачивания, в контроле обрабатывают дистиллированной водой. После подсыхания листовые пластинки (размеры 4 - 7 см) помещают в чашкиПетри с 10 личинками. Учет гибели личинок колорадского жука проводят на 3-е сутки, Число испытуемых концентраций препаратов должно быть не менее 5, количество опытов менее 4 с 3 повторностями в каждом.В табл.4 представлены летальные концентрации препаратов, вызывающие 100- ную гибель насекомых(на 1 г корма для непарного шелкопряда и 1 см листа растения для колорадского жука).Сравнительные данные инсектицидной активности штаммов показывают, что рекомбинантный штамм Т - 2 обладает совмещенным действием на представителей 1 ер 1 бор 1 ега и Соеорсега в дозах, сравнимых с исходными родительскими штаммами.Штамм Т - 2 эффективен против других видов насекомых в концентрации 10 спор/мл. На 4-е сутки наблюдается 100-ная гибель у следующих личинок насекомых-вредителей сельскохозяйственных культур: озимая совка (Ацгот 1 з зе 9 еМе),хлопковая совка (НеПой 1 з апп 19 ега), капустная совка (Мааезсга Ьгазз 1 са 1), отличная совка (Мавезтга зоаза), люцерновая совка (Не 11 осЫз чг 1 р 1 аса), донниковая совка 5 (НеПосЬз гпаг 1(1 ва), луговой мотылек(.охозСе 9 е зт 1 с 1 аПз),Штамм Тне обладает инсектициднойактивностью в указанной испытуемой дозепротивхищного клопа Роб 1 зоз гпасцПчеп 1 г 1 з,10 который используется как биологическоесредство подавления численности личинок колорадского жука (ерт 1 потагза бесевПпеата Яау). Следовательно, микробиологические препараты на основе штамма Т - 2 15 можно использовать в интегрированной системе защиты растений от колорадского жука совместно с биологическими средствами защиты растений, в частности совместно с хищным клопом для борьбы с колорадским 20 жуком.Таким образом, методом трансцепцииосуществлена передача плазмиды размером =60 т.п.н, из штамма-донора ТЕй в реципиентный штамм КО В. Передача 25 плазмиды коррелирует с появлением кристаллического включения (форма - плоский квадрат) белковой природы в штамме реципиента КОВ. Молекулярная масса этого белка примерно 70 кДа (определено 30 электрофореэом в 7 ф ПААГ в присутствииДС-натрия). По своим иммунологическим и инсектицидным свойствам этот белок соответствует кристаллическому белку штамма- донора ТЕМ. Следовательно, получен 35 штамм Т, который синтезирует д-эндотоксины исходных родительских штаммов. Рекомбинантный штамм Т - 2 является перспективным для использования в микробиологической промышленности с целью 40 создания препаратов, обладающих энтомоцидной активностью одновременно против представителей отрядов 1.ер 1 бор 1 ега и Соеорсега,Формула изобретения 45 Штамм бактерий ВасП 1 оз йцг 1 пд 1 епз 1 ззцЬзрМгзйаЬ ВКПМ В -4853 для получения энтомопатогенного препарата против 1.ер 1 бортега и Соеортега.-4 -лиШтамм Вас, й ТВТЕМ Титр жизнеспос в сппор., 10 спор/Таблица Проду еакция ивност тамм ноглоб Показана положительная акция кристаллических белков д-эндотоксина КОЙ и д-эндото Таблица блица,Осаулен еаакгар И.Шмако ррек раж Подписноекомитета по изобретениям и открытиям при ГКН Москва, Ж, Раушская наб 4/5 аказ 3759 Ти В-И 1 ПИосударственног 113035