Способ определения активности фосфолипазы с

(5 з 6 э 01 й 24/08 ООИ 063 ВЛ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Изобретение относиименно к энзимологии,Способ закл ние активности по изменению и сигнала фосфат ным ферментом ФХ до диацилгл биохимии ом, что измереы С проводится интенсивности (ФХ) с введенрасщеплеия сфсхолина, опючается в т фосфолипазтегральной дилхолина в процесс цирина и фо еме- азы ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии, Институт биохимии им. А.Н.Баха и Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) В.И,Решетняк, В,А.Еремин, С.Н.Дворянцев, А,С.Логинов, Э.К.Рууге и Г.Ф.Роэенблат(56) СаврЬе 111,0., Воуд 1 Вг 1 пс 11 е К.М., Охеу Я,Т, ИМЯ - вейосз аког зтвбу 1 пд епуве спет 1 сз. (Оерс. В 1 осЬев, Опч. ОХ 1 огс 1, ОХ 1 огб, ОХ 1 300, ОВ), "22 пс Сопдг. Авр 1 ге Мадп. Йезопап, апс Ве 1 ат. РЬепов. Ргос., ЕбгсЬ, 1984", ЕйгсЬ, 1984, р. 459 - 460,Регпапс 1 ег Е,1., С 1 аг 1 се О.Я. Мййзрестгозсору: а поп пчаз 1 че тоо аког злобупд ,1 и се 1 цаг ргосезз. Епгуве апс М 1 сгоЬ.ТесЬпо 11987, ч, 9, В 5, 259 - 271.Гог 1 п - СЬгзтепзеп 1 Рог 1 пС 1 гзсепзеп М, ет а 1. Ап ас 1 б рйозрЬоразе 1;1 гов 1 етгаЬувепа сцсоге веб 1 цв. Совр.ВосЬев, апс Роузо 1986, ч. 85, М 1, р, 143-148.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОЛИПАЗЫ С(57) Изобретение относится к биохимии, а именно к энзимологии. Цель изобретения - сокращение времени определения активноЦель изобретения - сокращение ви определения активности фосфоли,.,Ж 1682897 А 1 сти фосфолипазы С. Способ заключается я измерении активности фосфолипаэы С, которое проводится по изменению интегральной интенсивности сигнала фосфатидилхолина (Ф) с введенным ферментом в процессе расщепления Ф до диацилглицерина и фосфохолина, определяемое при регистрации 31 р-ямР спектров в течение часа после начала реакции,.Расчет проводят по формуле Е = ФХ ЛЯ 1000 10/Ят Б 32 25 (мкМоль/мин/мг), где ФХ - количество лецитина (Ф), дающее сигнал на спектре, мкМоль; Я - интегральная интенсивность исходного сигнала лецитина, в нормированных условных единицах; Л Б - изменение интегральной интенсивности сигнала за единицу времени, в нормированных условных единицах; 1 - время, за которое определяют изменение интегральной интенсивности сигнала, мин; Б - количество добавленного в образец фермента, мг; 1/25 - коэффициент пересчета количества ФХ, мг, на неорганический фосфат(РН) для ФХ с мол, мас. около 800; 1/32 - коэффициент пересчета количества Рн, мМоль, в ФХ, а при 1000 - в мкМоль; 10 - поправочный коэффициент, полученный эмпирически. Способ позволяет измерять активность фермента в процессе непрерывной реакции. 3 ил,ределяемое при регистрации 31 р-ямр спектров в течение часа после начала реакции,Расчет проводят по формуле ФХЛсо 1000 10Е 5, т, Б . 32, 25 мкМоль/мин/мг,О 15 20 25 30 35 40 50 где ФХ - количество л ецитина (фосфатидилхолина), дающее сигнал на спектре;5 - интегральная интенсивность исходного сигнала лецитина, и нормированных условных единицах;ЛЯ - изменение интегральной интенсивности сигнала эа единицу времени, в нормированных условных единицах;1 - время, за которое определяют изменение интегральной интенсивности сигнала, мин;Б - количество добавленного в образец фермента, мг;1/25 - коэффициент пересчета количества ФХ, мг на неорганический фосфат(Рн) для ФХ с мол.мас. около 800;1/32 - коэффициент пересчета количества Рн, мМоль, в ФХ, а при х 1000, мкМоль;10 - поправочный коэффициент, полученный на основе калибровки,Способ позволяет измерять активность фермента в процессе непрерывного протекания реакции,Способ осуществляют следующим образом,Озвученную суспенэию лецитина (не менее 100 мг) в 50 мМ Трис-НС буфере(рН 7,4) помещают в ампулу для ЯМР-спектроскопии и регистрируют спектр 31 р-ямр в течение времени, необходимого для накопления достаточного по интенсивности сигнала. При этом необходимо проводить измерение в режиме с как можно меньшим временем накопления сигнала (от 30 с до 3 - 5 мин),На фиг. 1 приведен типичный спектр 31 р-ямр озвученной суспензии ФХ в 50 мМ Трис-НС буфере(рН 74). На спектре обнаруживается один сигнал с химическим сдвигом 0,2 м,д., соответствующий фосфатной .группе фосфатидилхолина, Добавление в суспензию лецитина (ФХ) ионов кальция (в конечной концентрации 10-20 мМ) - активатора фосфолипазы С не меняет форму и интегральную интенсивность сигнала.Далее в ампулу добавляется фермент - фосфолипаэа С (не менее 1 мг), Образец быстро перемешивается и помещается в ЯМР-спектрометр -для регистрации серии 31 р-ямр спектров в течение 15 - 60 мин, В каждом из полученных 31 р-ямр спектров определяется интегральная интенсивностьсигнала фосфатидилхолина. Так как в процессе реакции от лецитина отщепляетсяфосфохолин, сигнал от фосфорной группыкоторого "( - ) 4 м.дто на н оо н-с-о-с-ро и-с-о-с-д н-с-о-нн С 2- диааио- гоииеоин о(сн,1, и О=Р-О-СН-Н1о- Фосфонооин и оиН-С-О-С-РОн-с-о-с-рН-С-О-Р-О-(Сно 1 о-Н-(СН,1 дН О ОЛсаанан Фооаооипа за С фатидилхолина в минуту при рН 7,3 и 37 С.П р и м е р. Озвученную суспензию лецитина готовят следующим образом, 100 мг лецитина (Харьковского предприятия по производству бактерийных препаратов) из раствора в спирте переносят в специальную ампулу для озвучивания. Спирт удаляют под вакуумом, а к лецитиновой пленке добавляют 2 мл 50 мМ Трис-НС буфера, рН 7,4. Озвучивание проводят на дезинтеграторе УЗДН - 1 (Харьковского завода) в течение 3 мин с паузами для охлаждения в режиме максимального резонанса при 0,3 мА, Далее образец центрируют при 2500 об/мин в течение 3 мин, Супернатант используют для работы. 2 мл озвученного лецитина помещают в ампулу для ЯМР-спектроскопии, Добавляют 0,5 мл Д 20 и 50 мкл 1 М СаС 2, Регистрируют 31 р-ямр спектр субстрата (фиг, 1). Спектры 31 р-ямр высокого разрешения образцов лецитина регистрируют на ЯМР-спектрометре с рабочей частотой 81 МГц при 37 С без вращения ампулы и беэ подавления спин-спинового взаимодействия ядер 31 р с протонами. Спектры 31 р-ямр спектрах в процессе реакции сигнал от фосфатидилхолина (лецитина) уменьшатся, а в области ( - 4 м.д.) появляется и возрастает со временем сигнал от фосфохолина (фиг, 2),Интегральная интенсивность сигнала в спектрах 31 р-ямр пропорциональна количеству ядер фосфора и соответствует определенному количеству лецитина в образце.Кинетика уменьшения интегральной интенсивности сигнала ФХ, измеренная в процессе фосфолипазной реакции, отражает активность фермента фосфолипазы С, Чем больше скорость падения сигнала, тем активнее препарат фермента,Зная интегральную интенсивность сигнала, строят график зависимости ее от времени ферментативной реакции (фиг. 3) и определяют активность фермента по указанной формуле.Способ апробирован с использованием препарата фосфолипаэы С иэ бактерий Сапсба УЧесЫ фирмы "Вцтаи с активностью 5 ед/мг, 1 ед. высвобождает 1 мкМоль водорастворимого органического фосфора из Е - а -фос 1682897получают с использованием 45 О - х импульсов и временем выборки 0,82 с с задержкой 1 с. Снижения уровня шумов достигают ум. ножением функции спада сигнала свобод-ной индукции на экспоненциальную функцию. Значение химических сдвигов 5 сигналов в спектрах в миллионных долях (м.д.) приведены относительно сигнала 85 оНзР 04,В ампулу с лецитином добавляют 1 мг фермента - фосфолипазы С, быстро переме шивают и каждые 2,5 мин регистрируют спектры 31 Р-ямр в течение 60 мин в процессе расщепления фосфатидилхолина до диацилглицерина и фосфохолина. В исходном спектре и первом спектре после добавле ния фосфолипазы С интегральная интенсивность сигналов фосфатидилхолина одинаковая - 80,2 нормированных условных единиц, Строят график зависимости между интегральной интенсивностью сиг нала фосфатидилхолина и временем реакции (фиг. 3). Далее по графику определяют изменение интегральной интенсивности сигнала фосфатидилхолина с введенным ферментом за единицу времени, например 2 за 10 мин (фиг. 3) - 3,5 нормированных условных единицы, Исходная интегральная . интенсивность сигнала ФХ равна 80,2 нормированных условных единицы и обусловлена она 80 мг лецитина. В 2,5 мл образца 3 ( 2 мл озвученного фосфатидилхолина+ 0,5 мл Д 20) содержится 100 мг лецитина. Однако сканирование спектра происходит лишь с объема 2 мл, вокруг которого имеется магнитная катушка ЯМР-спектрометра,2 мл со держимого ампулы составляет 80 мг лецитина. Подставляют данные в формулу и получают 5 где ФХ - количество лецитина (фосфатидилхолина), дающее сигнал на спектре,мкМоль;3 - интегральная интенсивность исходного сигнала лецитина, в нормированных 0 условных единицах;Л 3 - изменение интегральной интенсив:-ости сигнала за единицу времени, внормиро;анных условных единицах;т - время, за которое определяют изме нение интегральной интенсивности сигнала, мин;Б - количество определяемого в образце фермента, мг;1/25 - коэффициент пересчета количества ФХ, мг, на неорганический фосфат Р)для ФХ с мол,мас. около 800;1/32 - коэффициент пересчета количества Рн, мМоль, в фосфатидилхолине, а прих 1000 - в мкМоль;10 - поправочный коэффициент, полученный на основе калибровки. 80 х 3,5 х 1000 х 10 40 Из фиг. 3 видно, что для измерения активности фермента фосфолипазынеобхо димо и достаточно получение 5-10 802 х 10 х 1 х 25 х 32 4,4 м к Мол ь Р н/мин/мг.экспериментальных точек в первые 15-20мин проведения реакции. Способ позволяетбыстро и достоверно определять активность фосфолипаэы С,Формула изобретения Способ определения активности фосфолипазы С, предусматривающий расщепление озвученного фосфатидилхолина до диацилглицерина и фосфохолина с последующим расчетом ее по формуле, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью сокращения времени определения, регистрируют 31 р-ямр спектр субстрата и серию спектров 31 р-ямр с введенным ферментом в процессе расщепления фосфатидилхолина до диацилглицерина и фосфохолина, определяют интегральную интенсивность субстрата и изменение интегральной интенсивности с введенным ферментом за единицу времени, а активность фермента рассчитывают по формуле ФХ Л 3 1000 10ЕБ 32 25 мкМоль/мин/мг,1682897 ицн. ощ рРакции ал а цал рад РигНа б-РУмен ап и д- бй мин пщ на 1 - сигнал рос,р 2 4 б1682897 085 Редактор М.Стрельнико рректор О.Кравцов каэ 3408 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 нно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 Произв ставитель И.Чаплинхред М.Моргентал Ю Юй(мои)