Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами

557521 мои люцифераэои. люциферазаФИНН + СОН + О-- + ФМН + КСООН + Н О + свет21 Полученный в этой реакции ФМНН используется в реакции, катализируе где ФМН ФМНН - окисленная и восста 9новленная формы флавинмононуклеотида;+НАД,НАДН - окисленная и восста Оновленная формы никотинамиддинуклеотида;:ВСОН - длинноцепочечный алифатический альдегид;,ИСООН - соответствующая жираная кислота,Особенностью этой системы являетсято, что одним из продуктов реакцииявляется светоизлучение в сине-зеле-.ной области спектра (длина волн 520- 20600 нм),Экстракты зерна не флуоресцируютЗерно размалывают, проводят водную экстракцию, затем из экстрактаудаляют остатки размолотого зерна, 25Приготавливают реакционную смесь, содержащую НАДИ:ФМН-оксидоредуктазу,люциферазу и субстраты ФМН, НАДН иЯСОН. Реакцию инициируют добавлениемНАДН и измеряют интенсивность биолюминесценции на специальном приборебиолюминометре, который состоит изкюветной части, фотоэлектроумножителя, усилителя фототока и регистрирующего устройства (самописец, осциллограф и т,п.).Как видно,из зависимости, представленной на чертеже, в течение некоторого времени после начала реакцииинтенсивность свечения растет, достигает своего максимального значения изатем начинает медленно падать, Через 20-30 с после достижения максимума биолюминесценции измеряют величину1, и затем в реакционную смесь добав" 45кляют водный экстракт зерна, наблюдаютпри этом снижение интенсивности биолюминесценции, измеряют 1 и по величине отношения 1 /1 судят о степени поражения зерна; чем меньше величина 1 /1 , тем сильнее поражено зерно,П р и м е р 1Водные экстрактызерна кукурузы приготавливают следующим образом: к 10 кг размолотогозерна добавляют 30 мл д 10 , экстра"гируют при постоянном встряхивании накачалке в течение 1 ч и центрифугируют 5 мин при 5 тыс,оборотов в 1 мин,Для измерения интенсивности свечения приготавливают реакционную смесь,содержащую 50 мкл раствора НАДН:ФМНоксидоредуктазы (О, ед, активностивмл), люциферазы (0,3 мг/мл) иФМН (810 з М), 50 мкл О, 0025/-ногораствора тетрадеканаля, 200 мкл0,1 М фосфатного буфера рН 6,8,200 мкл 4 10 М раствора НАДН, Интенсивность свечения этой реакционнойсмеси измеряют на биолюминометре вусловных единицах, В отсутствие водного экстракта (контроль) интенсивность свечения 1= 37 усл,ед.При внесении в реакционную смесь20 мкл водных экстрактов кукурузы,зараженной в разной степени метаболитами грибов, интенсивность свеченияпадает, измеряют 1.В табл,1 представлены примеры реализации способа для образцов зернакукурузы,Точность метода определяли, измеряя среднеквадратичную ошибку в серии из 3-5 измерений для каждого об.разца, Из табл, видно, что ошибкане превышает 107. Таким образом, точность .метода увеличена по сравнениюс прототипом в 2,5-3 раза, время анализа. сокращено до 1 ч. т,е, в 6-7 разметод прост в исполнении, уменьшенытрудовые затраты по сравнению с прототипом,П р и м е р 2, В табл,2 представлены примеры реализации способа придобавлении в реакционную смесь разных количеств водных экстрактов кукурузы образца3 (количество грибов 444,5 тыс/г, содержание ЗФС1040 мг/кг).Как видно из приведенных данных,реализация предлагаемого способа независит от количества добавляемогоэкстракта зерна,Таким образом, предлагаемый способ позволяет при использовании разных количеств экстракта зерна повысить точность определения и уменьшитьвременные и трудовые затраты,П р и м е р, .3, Водные экстрактынормальной и плесневелой пшеницы приготавливают следующим образом: к 3 гразмолотого зерна добавляют 9 мл1557521 6Как видно из табл,5, с увеличением количества фузариозных зерен воз-растает степень ингибирования биолюминесценцииТаким образом, сравнение примеров 1,2 . и пр.жеров 3,4,5, осуществленных при разном выборе соотношениякомпонентов, входящих в реакционнуюо 10 смесь, показывает, что от выбора сол) отношения компонентов, входящих в)реакционную смесь, не влияет на рет- зультаты определения, Так как измерения степени поражения зерна всегда15 проводят по величине относительногоизменения интенсивности свечения1 /1 , то абсолютные величины 1ое, и 1 х не имеют значения при реализации способа,20 П р и м е р б, В табл,6 представлены примеры реализации способа дляи- разных количеств водного экстрактае- нормальной и фузариозной (30% фузаРиозных зерен)пшеницы, Условия изме 25 рения аналогичны примеру 3.тКак видно из данных табл,б предлагаемый способ реализуется при разныхколичествах экстракта зерна пшеницы,добавляемого в реакционную смесь,30 Однако в зависимости от сорта видазерна может меняться величина 1/1,Количество экстракта подбирается экспериментально,Таким образом, предлагаемый способа позволяет увеличить точность измерения в 3-4 раза (ошибка измерений непревышает 103), уменьшить трудовыеа- затраты, Предлагаемый способ является экспресс-методом (время одного.иэ 40 мерения 1-1,2 ч), прост, доступен, мое- жет быть использован для рутинных изД- мерений,дНО, экстрагируют при постоянномвстряхивании на качалке в течение10,30,60 мин при 30 С, Далее экстракты центрифугируют при 5 тыс,оборотовв 1 мин в течение 5 мин, либо фильтруют через бумажный фильтр,Для измерения биолюминесценции прготавливают реакционную смесь, содержащую 50 мкл раствора НАДН:ФМН-оксидредуктазы (0,01 ед, активностив 1 млюцифераэы (0,015 мг/мл), ФМН(1,7 10 М), 50 мкл 0,00252-ного расвора тетрадеканаля, 500 мкл О,1 Мфосфатного буфера рН 7,0, 200 мкл-ФНАДН (410 М) . Интенсивность свечения этой реакционной смеси измеряютв условнйх единицах на биолюминометр10 мкл экстрактов зерна добавляютв реакционную смесь после достиженияпостоянной интенсивности биолюмннесценции (1) и измеряют 1 после достжения нового уровня интенсивности свчения в присутствии экстракта,В табл.З представлены примеры реализации способа в зависимости от вреиени экстракции.Иэ табл,З видно, что результатыреализации способа практически не зависят от времени экстракции, от приема отделения остатков зерна: центрифугированием или фильтрацией,Данные по определению количествабелка в экстрактах, приведенные втабл,3, свидетельствуют о том, что нрезультаты определения не влияют .время приготовления экстракта и способ отделения обломков зерна (содержние белка в экстрактах практическиодинаково).П р и м е р 4, В табл.4 представлны примеры реализации способа для воных экстрактов зерна кукурузы, зараженного в разной степени микроскопическими грибами, Приемы измерения свечения аналогичны приведенным в примере 3, В реакционную смесь добавляют20 мкл водного экстракта кукурузы.Из табл,4 видно, что имеется связьмежду количеством грибов, содержанием ЗФС и величиной 1 /1 (с увеличением степени поражения зерна величина Хд/1 уменьшается).П р и м е р 5В табл,5 представлены примеры реализации способа дляпшеницы, Условия измерения аналогичны примеру 3. В реакционную смесь до"бавляют 5 и 10 мкл водного экстракта пшеницы,Формула изобретения Способ определения степени пораже-, ния зерна микроскопическими грибами, заключающийся в размалывании зерна, приготовлении экстракта, введении его реакционную смесь и определении в экстракте наличия грибных метаболитов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения и упрощения способа, в ка- . честве реакционной смеси используют смесь, содержащую НАДН:ФМН-оксидоредуктазу, люциферазу и их субстра- ты, наличие метаболитов в экстракте определяют по интенсивности их свече1557521 присутствии экстрактов зерна и безнего,ния, а о степени поражения зерна судят по отношению интенсивностей биолюминесценции реакционной смеси в Таблица 1 Количество грибов разных видов,.Фтыс/г Концент-Т, 1/1,;%рация усл,ед,ЗФС,мг/кг Общее коли 0 0 . 0,3 010 в 5 0 260 3640 70,0 95,0 1040 Таблица 2 Количест- . 1 в 1 в 1/1, %ВО ВОДНО УСЛа ЕДв УСЛа ЕД а ГО ЭКСТрак та,мкл 5 42 10 42 20 40 50 40 301913,55,5 Т а блица 3 Время экстракции, мин То /1 кв% Пшеница плесневелая Пшеница нормальная 5 мкл 10 5 мкл 10 мкл 20 мкл Белок мг/мл1557521 10 Таблица б Таблица 5 КоличеКоличество фузариоэйых зерен пшеницзМу Х ство эк"стракта,мкл Пшениц узари зная ниц 10 льна 30,53141,129,3 61ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ ССС 113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 45