Способ получения протопластов плодовых растений

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5 4 С 12 И 5/00 с" 91",")( ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ образом ю культуру клетокраствор пектофоенгина и целлобиазы 1 - 2,0 Х. Инкубациюо тате при 26 С в теение протопластов мошью центрифуги,В суспензионну вносят ферментный тидина, целлюкони в концентрации О, проводят в термос чение 16 ч. Осажд с ествляют с по ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ П 1 НТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Центральная генетическая лаборатория им, И.В.Мичурина и Всесоюзный научно-исследовательский институт микробиологических средств защиты растений и бактериальных препаратов(56) Авторское свидетельство СССРКф 718052, кл. А 01 С 7/00, 1978(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВПЛОДОВЫХ РАСТЕНИЙ Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции, в генетике и физиологии растений для получения протопластов.Целью изобретения является повышение выхода протопластов.Способ заключается в повышении суспензионной культуры клеток и инкубации их в растворе композиции ферментных препаратов, при этом в качестве ферментиых препаратов используют пектофоетидин, целлюконингин и целлобиаэу в концентрации О,1 2,0 Х каждого. Активность ферментов при этом составляет, ед,/г: пектинаэа 36-40; 1,40-глюкан-целлобиогидролаэа 45-50; 1,4глюканаза 50-55; экзо,4глюкоэидаэа 35-40; целлобиаэа 180-200. 801527258 А 1 2(57) Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в генетике, селекции, физиологии и клеточной инженерии растений. Целью изобретения является повышение выхода протопластов. Способ состоит в использовании для гидролиэа клеточных стенок растений новой композиции пектолитических и целлюлолитических ферментов, Способ позволяет получить большое количество протопластов с высоким содержанием жизнеспособных, пригодных для нужд клеточной селекции. При этом используются ферменты микробного происхождения, что позволяет обходиться без дорогостояЮ ших импортных ферментов, 4 табл,Способ осуществляется следуюши Основное требование, предъявляемое к подбору композии ферментов, состоит в том, чтобы все выделенные протопласты имели шаровидную форму с равномерный распределением хлоропластов.П р и м е р 1, Испытывают влияние ферментных препаратов пектофоети дина, целлюконингина и целлобиаэьг на35 количественный выход изолированныхпротопластов иэ клеток листьев смородины и каллусной ткани земляники.Суспензионную культуру клеток смородины (сорт Память Мичурина) выделя 5ют из розеток листьев, выращенных изапикальных меристем в условиях стерильной культуры на искусственнойпитательной среде.1 ОСуспенэионную культуру клеток земляники (сорт Рубиновый кулон) выделяют иэ каллуснок ткани, выращенной вусловиях стерильной культуры на искусственной питательной среде.15Пектофоетидин, целлюконингин ицеллобиазу (образцы промышленных препаратов) вносят в концентрациях 1,0и 2,07. Опыт ставят в трехкратнойповторности. В качестве контроля испытывают ферментный препарат - иектинаэу (очишенную без наполнителя) вконцентрации 1 Х. Все ферменты растворяют в смеси растворов 0,4 М Рманнит, 0,3 М СаС 1. и 0,7 М ИаНРОд . 25В вариантах, где применяют пектоФоетидин, целлюконингин, и целлобиаэу, почти все иротопласты листа смородины и каллусной ткани земляникиосвобождаются от клеточных стеноки оказываются сусиендированными винкубационной смеси. Существенныхразличий по количественному выходу изолированных протопластов от применения каждого из этих Ферментовне наблюдается,Выход жизнеспособных протоиластов из 1,0 г листовой ткани смородины при использовании пектофоетидина составляет 7,5 10 и,/мл, ири ис 540пользовании целлюконингина - 5,8 "ф 10 п./мл ири применении целлобиа 66эы - 6,4 10 п./мл (табл, 1),На таком же уровне наблюдаетсясодержание изолированных иротоиластов в контроле (1,0 10 п/мл), где7 45применяют пектиназу.Содержание изолированных протопластов из клеток,каллусной тканиземляники при использовании бектофоетидина, целлюконингина и иектиназысоставляет 1,2 ф 10 п,/мл, а при исбпользовании целлобиаэы - 1,0 10 п./мл.Данные опыта показывают, что предлагаемые Ферменты - пектофоетидин,целлюконингин и целлобиаза обладают комплексом Ферментных систем,активно разрушающих клеточные стенки плодовых культур и сиособствуюших получению жизнеспособных иротоиластов, причем эффективность ферментов значительно выше, чем в известных способах (табл. 2-4).Таким образом, предлагаемый способ получения протопластов расширяет использование композиции из целлюлолитических и пектолитических ферментов, которые могут с успехом заменить импортные препараты при получении протопластов плодовых культур, а также снижаются затраты времени и денежных средств.Для доказательства жизнеспособности протопластов используются такие красители, как триисиновый синийили метиленовый синий. Отбирается часть окрашенной суспензии протопластов (равный объем суспензии протоиластов и 0,1 Е-ного трипсинового синего), пастеровской пипеткой заиолняется сетчакая камера Фукса-Розенталя, определяется концентрацияживых иротопластов в исходной суспензии, Окрашенные иротопласты нежизнеспособны. Жизнеспособные протопласты не окрашиваются,Результаты проведенных исследований показали, что после первогодня культивирования жизнеспособностьпротопластов, выделенных из клетоклистовой ткани смородины сорта ПамятьМичурина, иод влиянием ферментов -иектиназы, иектофоетидина, целлюконингина и целлобиазы различаетсяв пределах 70-802, У других видов исортов смородины (ВцЬцэ ашег 1 саи 1 сцщи сорт Голубка) жизнеспособность протоииастов находится на уровне 60-80 Х,Жизнеспособность протопластов, выделенных из клеток каллусной ткани земляники сорта Рубиновый кулон составляет более 903 протопластов. У других видов и сортов земляники (Гга 8 аг 1 а шаэсЬаСа и Фестивальная) жизнеспособность протопластов 60-903.Указанные ферменты положительно используются в работах по выделению других видов плодовых растений (яблоня и груша).При оптимальных условиях культивирования протопласты регенерируют клеточную стенку, клетки делятся с образованием клеточных колоний и формируют каллусные ткани. Успешно выделенные протопласть 1 иод влиянием Ферментов - пектиназы, иектофоетиди7258 6шения выхода протопластов, в качестве ферментных препаратов используютпектофоетидин, целлюконингин и целлобиаэу в концентрации 1,0 - 2,0 Е каждого, причем активность ферментов приэтом составляет, ед,/г: 152 на, целлюконингина и целлобиазы используются в исследованиях по соматической гибридизации 1 гибридизация клеток методом слияния изолированных протопластов). Формула и з о б р е т е н и я 36-40 10 Способ получения протопластов плодовых растений, включающий получение суспенэионной культуры клеток и инкубацию их в растворе композиции ферментных препаратов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повы 45-50 50-55 35-40 180-200.15 Таблица Источники Количество Условия изолирования протопластов протопластов в сус- пенэнонной Осмотический с таб ил из а то р Время инкубации,ч Концентрация Ферментныйпрепарат ферментного культуре, п./мл репараа, 7 1,0 10 0,4 М Р-Маннит 16О,ЗМ СаС 10,7 М ИаНРО 1,0 Клеткилистовой тканисмородины 7,5 1 О 5,8 10 16 1,0 То же 16 2,0 6,4 10 1,2 10 16 16 2,0 1,0 Клеткикаллуснойткани земляники 16 1,0 16 2,0 гинЦеллобиаза и 16 2,0 1,2 1 О 1,210 1 Пектиназа1527258 Таблица 2 Условия изолирования протопластов Количество протопластов в суспенэионной культуре,и./мл Источники 1 Концентрацияферментного препарата, Х Активность ферментовв препарате, ед./г Ферментныйпрепарат 6 реня инкубации,ч Осиотнческий стабилизатор 0,5 ПектинВ 9 В(очиненнаябез наполнителя) 04 Н 0-Нвннит 1636 О,ЭМ СВС 1945 0,7 Н НВНРО+5035180 Клетки лнсто"вой тканисмородины 3,0. 10 05 То мв Пектофоетидин 16 То ме 36 40 25 100 45 50 35 150 45 50 38 180 2,4 1 О 0,5 Целлюконннгнн 16 Эндо-глюканазаЭкзо-глюкозидаза Целлобиаэа 7,0 10 1,0 Целпоб пав В 6 Пектннава(очиненнаяОеэ нвполнителя) 90 1 О Клетки каллусной ткани земляники 7,3 10 0,5 То ме Целлюконннгнн То ве 38 42 46 30 175 45 50 38 180 45 53 36 180 Эндо-глюканаваЭкзо-глюкозидаза 8,6 10 Целлюконингин 1,О 16 6,0 1 О 1,0 16 Целлобнава Таблица Э Условия изолирования протопластов оличестворотопластосуспемэиоой культурп./мл Осмотическнй стабилизатор Время инкуОвцни,ч Ферментный препаратонцентрация ерне 71 того преАктивность фериенто в препарате, ед,/г врата Х 0,50,4 Н П-Нанни40 О,ЗН СВС 1942 0,7 Н ПВНРОЭ52 Клетки листовой тканисмородины интел То ме о ме ектофоендин 404550150505540505540 6,6 10 Целлюконингин(очзваннаяОеэ наполОбмая пектинавная активностьЦеллобиогидролянаЭИДО ГЛЮКВИВ 9 ВЭкзо Глюк 09 ндВзВ ЦеплобиазаОбвея пектиназная активностьЦеллОЬиОГидрола 9 ВЭкзо-глюкоэндаэаЦеллобиава Целлобиогндролвъа ЦеллобиогндролазаЭндо-глюканазаЭкзо-глюкоэидаза ЦеллабиазаОбмая пектинавиая активностьЦеллобногидролаваЭндо-глюканаза Эх 90 ГлюкозидВэВЦеллобиаэаОбаая пектиназная активностьЦеллобногидролаза Целлобиава Целлобиогндролаза Эндо-глюканазаЭк 90 ГлюкоэидВзВЦелпобнаваЦеллобногндролазвЭндо-глюквназаЭкэо-глюковидаэаЦеллобиаза Обаая пектиназнаяактивностьЦелпобиогидролазаЭндо-глюканаэаЭкво-глюковндаэа,ЦеллоЬиаэаОбавя пектинаэнвяактивностьЦеллобногидролвэаЭндо Глюка 9 идаэаЦеллобиаваЦеллобиогидролазаЭндо-глюквнаэаЭкэо-глюкозидазаЦеллобиогидролаэаЭндо-глюканазаЭкзо Глюк 09 идаэВ 35 0,4 М 0-Нвннит 1642 О,ЭН СВС 1948 0,7 М МВНРОЗ3316010 1527258 Продолжение табл.3 Условия изолирования протопластов Количество Источники протопластов в суспензион ной культуре 8 реми инку" Осмотичес Концентктивность фермен препарате, ед./ ерментныйпрепарат нзатор рацияферментного препарата, 2 ии 20 я 3 а 4Целпобиаэа 0 Общая пектиназна активность 8 Целлобногндролаз 3 Эндо-глюканаэа 56 Экзо-глюкоэндаза 38 Целлобиаза 185 Общая пектиназная активность 40 Целлобиогидролаэа 48Эндо-глюканаэа 52, Экзо-глюказидаза 38 Целлобнаэа 185 Целлобногидролаэа 50 Эндо-глюканаэа 55Экэо-глюкозндаза 42Целлобнаэа 200Целлобиогидролаэа 50Эндо-глюканаза 55Экзо-глюкозндаза 40Целлобиаза 200 О0 1 О Клетки кал 0,4 М О-Манн0,3 Са 01,0,7 М НаНРОс Пектиназа(очищениябез наполнителя) усной ткан земляники 1,7 10 То ве Пектофоети Ос Целлюконин,еллобиаза 4 Табл Источники фермен ый препарат - Количе тво протопластов в имостн от концентр за 2Оаа,0 Клетки лнс товой ткаи ектолнтнческие рменты:пектиназа (очищенная без наполиителя)пектофоетидии ллвлолитическне рменты:целлюконингин смородины сорта Пенят Мичурина,8 1 О ,О О 7,0 1 От 8, О 58 ф 10 811 О6 4 10 7 10 4 10 0 10 6,8 10 7,71 О целлобиаэаектолитические Клетки каллусной тканземляники Рубиновый кулон менты:пектинаэа (очищенная беэ на- полнителя 1,6 10 1,3 1 О 1,О 1 О 1,710 10с с 1 О 1,2 9 О 10 7,3 10,1 1 О ,210 1 ОНивний предел активности ферментов.ввИаксимальный предел активности фермент оставитель В. Демкинехред М.Дидык Корректор Т. Палий едактор О. Ю овецкая Тираж 501комитета по изобретени Москва, Ж, Раущская Заказ 7481/ Гагарина, 10 кий комбинат "Патент", г.Ужгор НИИПИ ГосУдарственно 11303Производственно-издател суспенэионной культуре, п. /мл, ции ферментнык препаратов, ХГ ГПодписноеи открытиям при ГКНТ СССРаб., д. 4/5