Способ консервирования живых клеток или тканей растений

:дух"л.;Й)МА А 1 ГА ТИО-а, ,г. 4 1 г ЙА ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Т,11,. ВКЬЛИО Г. Бугэну)Эффи О ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт физиологии растений им. К. А, Тимирязева(56) 1. 1 ощ 1 П У Е., оапщп е 1 цЬеговнгп; а гподе 1 аког з 1 цду 1 пд Фе сгуоЬ 1 ооду о 1 вЬоо 1-11 рз 1 п Фе тпЬег-Ьеагпд о апшп врес 1 ез. Рап 1 Яс 1 епсе 1.ет 1 егз, ч. 20,4, 1981, р. 315.2. Попов А, С. и др. Возобновление суспензионной культуры клеток женьшеня Рапах рпвещ С. А. Меу после глубокого замораживания, Доклады АН СССР. т. 262,3, с. 765, 1982 (прототип).(54) (57) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОК ИЛИ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ, включающий их культивирование в питательной среде, внесение раствора криопротектора в емкость с клетками или тканями с образованием в ней зоны раствора криопротектора и зоны клеток или тканей, последующее глубокое замораживание с затравкой кристаллизации и хранение в криогенной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности клеток или тканей, затравку кристаллизации производят хладагентом, имеющим температуру в 10 - 13 раз ниже температуры замерзания раствора криопротектора, причем забавку производят в зоне раствора криопротектора.1144673 40 45 50 55 1Изобретение относится к криогенным методам консервирования и хранения живых клеток и тканей как непосредственно выделенных из организма растения, так и длительно культивируемых на искусственных питательных средах и составляющих основу биотехнологии производства ряда ценных, в частности лекарственных веществ, природное растительное сырье для получения которых уже исчерпано.Известны способы сохранения живых 10 клеток и тканей путем их культивирования или инкубации в природных или искусственных питательных средах, добавления криозащитных веществ, глубокого программного замораживания, хранения в жидком азоте, оттаивания и рекультивирования. В случае особо чувствительных к данной экстремальной процедуре клеток, например клеток растений, наибольшая жизнеспособность достигалась при использовании программ замораживания с затравкой (инициацией кристаллизации криозашитного раствора, в котором находятся живые клетки и ткани). Затравку обеспечивали с помощью внесения в пробирки с клетками и тканями кусочков льда 111.Недостатками указанного способа яв ляются необходимость стерильных условий в процессе затравки, а также сложность и трудоемкость этого процесса, если работают с большим числом ампул.Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ консервирования живых клеток или тканей растений, включающий их культивирование в питательной среде, внесение раствора криопротектора в емкость с клетками или тканями с образованием в неи зоны раствора криопротектора и зоны клеток или тканей, последующее глубокое замораживание с затравкой кристаллизации и хранение в криогенной жидкости 12,Клетки и ткани, находящиеся в питательной среде осаждают, избыток среды удаляют, а к осадку клеток добавляют криозашитный раствор. Затем их переносят в цилиндрические полиэтиленовые ампулы (наружный диаметр 10 мм, внутренний 8,6 мм, высота до пробок 24 мм, полезный объем 1 мл). Ампулы (до 30 шт, одновременно) помещают в плоскую кассету с перфорированными стенками. Если ампул немного, их помещают вертикально на одном уровне в штатив, Штатив или кассету переносят в камеру программного замораживателя и охлаждают до температуры на 1 - 2 С ниже точки замораживания раствора криопротектора. Очень быстро вынимают кассету или штатив и на 0,5 - 1,5 с погружают в жидкий азот всю кассету или дно ампул в штативе и сразу же возвращают их в камеру. После окончания замораживания ампулы переносят в жидкий азот для хранения. 2Таким образом, при осуществлении этого способа затравка может привести к прямому повреждению части клеток слишком низкой температуры (жидкий азот - 196 С) и не получиться в некоторых ампулах, так как при погружении кассеты жидкий азот вскипает, и пузырьки смеси его паров с воздухом могут воспрепятствовать проникновению жидкости в кассету и касанию ею всех ампул без исключения.Целью изобретения является повышение жизнеспособности клеток или тканей.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу консервирования живых клеток или тканей растений, включающему их культивирование в питательной среде, внесение раствора криопротектора в ем. кость с клетками или тканями с образованием в ней зоны раствора криопротектора и зоны клеток или тканей, глубокое замораживание с затравкой кристаллизации и хранение в криогенной жидкости, затравку кристаллизации производят,хладагентом, имеющим температуру в 10 - 13 раз ниже темпе.ратуры замерзания раствора криопротектора, причем затравку производят в зону раствора криопротектора. Дополнительный хладагент имеет ее сверхнизкую температуру, а лишь необходимую и достаточную для затравки. Такая тем пер атура дол жна быть в 10 - 13 раз ниже точки замерзания криозащитного раствора. Этот хладагент действует строго локально, только на самую верхнюю узкую (2 - 3 мм) зону обычных ампул, где расположен мениск раствора, в то время как клетки и ткани оседают на дно ампул и даже самые верхние из них находятся не ближе 12 мм к зоне действия дополнительного хладагента. Обеспечивается это тем, что ампулы находятся в специальном штативе, представляющем собой чашку с плоским дном, причем в дне имеются отверстия, диаметр которых точно соответствует диаметру ампул. Ампулы закрывают эти отверстия плотно, так как пробки и дно штатива располагаются на 2 - 3 мм ниже мениска раствора в ампулах. В отдельных случаях, когда объекты плавают на поверхности раствора криопротектора, а не оседают в нем, ампулы могут быть вставлены в те же отверстия толькосвоей донной частью. В этих условиях уровень мениска дополнительного хладагента, наливаемого в чашку-штатив в момент затравки, на 2 - 3 мм выше дна, и расстояние между ним и клетками сохраняется приблизительно тем же, Дополнительный хладагент представляет собой спирт, охлажденный с помощью сухого льда до рассчитанной температуры в отдельном сосуде.Способ осуществляют следующим образом.1144673 ТаблицаЖизнеспособность (Ж) клеток диоскореи дельтовидной Способ затравки До замора- живания После замораживания хранения- оттаиванияСреднеезначение Отдельныеопределения Погружение днаампул в жидкий азот на 1,0-1,5 с 22,5 18,6 19,5 76,0 21,0 8,0 22,0 Затравка с помощью дополнительного хладагента 51,0 50,8 56,0 76,0 48,0 50,0 49,0 3В данных экспериментах для замораживания использовали длительно культивируемые и ранее хранившиеся в жидком азоте клетки тропической лианы диоскореи дельтовидной. Осаждение клеток, добавление криопротектора (диметилсульфоксид ДМСО, 5 7%) и перенос в ампулы проводили точно так же, как в способе-прототипе, Количество клеток было таким, что они оседали на дно ампул в виде слоя, высота которого была около 1 мм. Ампулы вставляли в специальный штатив, В центр штатива вставляли контрольную ампулу, в которую вводили термодатчик программногозамораживателя ЗП 00.00.00. Конец термодатчика располагался на уровне дна штатива, горизонтально установленного в камере аппарата, Снижение температуры проводили со скоростью 0,5 С/мин и стабилизировали ее при -6 С. Тем временем в небольшом сосуде Дьюара охлаждали спирт до -33 -38 С, так как точка замерзания питательной среды с 7% ДМСО равна -2,82 С. Открывали крышку камеры, вливали в штатив этот спирт и закрывали крышку.На чертеже представлены термограммы опытов.Через 15 с температура в зоне мениска контрольной ампулы начинала снижаться (нижняя кривая).Пример 1. При температуре около -8 С начиналась кристаллизация в этой зоне и 4температура в ней начинала подниматься. Подъем температуры продолжался более 4 мин и достиг приблизительно точки замерзания. Следовательно, начальная кристаллизация проходила очень медленно, что благоприятно сказывается на жизнеспособности Верхние кривые являются фрагментами термограмм, полученными в опытах, в которых концентрация ДМСО была 10% и точка замерзания - 4,12 С. Моменты затравок показаны стрелками, над которыми указана температура дополнительного хладагента. Только при снижении ее почти в 10 раз или ниже по сравнению с точкой замерзания появлялись типичные пики кристаллизации. При более высокой температуре дополнительный хладагент вызывал лишь кратковременное снижение температуры в зоне мениска раствора с последующим возвращением к температуре камеры (показана пунктиром в те периоды, когда после кристаллизации она не совпадала с температурой ампул).После окончания программы замораживания ампулы хранили в жидком азоте несколько дней, быстро оттаивали и определяли жизнеспособность клеток по окраске с феносафранином. В таблице представлена жизнеспособность (%) клеток диоскореи дельтовидной.1144673 Составитель Е, Новикова Техред И. Верес Корректор Н. Король Тираж 743 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4Редактор Н. ШвыдкаяЗаказ 1002/2 5Пример 2. Длительно культивируемые клетки наперстянки Жр 1 а 115 1 апа 1 а специально подготавливали к глубокому замораживанию, для чего при очередном их пере- севе добавляли в питательную среду осмотически активное вещество - маннит в кон 5 центрации 3%. Для клеток наперстянки такая подготовка обязательна для успеха глубокого замораживания, так как после нее большинство клеток имеет сравнительно небольшие размеры и меньшую вакуолизацию, 0 что благоприятствует их выживанию. Клетки осаждали как в способе-прототипе, и добавляли криопротектор: смесь глицерина и сахарозы до конечной концентрации 10% каждого из этих веществ. Остальные операции проводили точно так же, как в примере 1, но с учетом другой точки замерзания раствора криопротектора (-3,4 С) и, следовательно, температура дополнительного хладагента должна быть не выше -34 С. На этих клетках был испытан весь диапазон 20 скоростей охлаждения, обеспечиваемый аппаратом ЗП.00.00.00 от 0,5 до 75 С/мин. Эти результаты показали, что наилучшей для клеток растений является скорость 0,5 С/мин.25 Пример 3. Использовали длительно культивируемые клетки женьшеня Рапах 1 х 1 пвепд, При этом в случае исходного штамма ИФР Ж 1 можно обойтись без специальной подготовки клеток и применить тот же криопротектор, как и для клеток наперстянки. В случае же мутантных штаммов ИФР Ж 2 и ИФР Ж 3, которые менее устойчивы к глубокому замораживанию, необходимо специальное предварительное культивирование в течение 3 недель при пониженных темпе ратурах (первая неделя при 8 - 10 С, затем при 2 С) и при еженедельном увеличении концентрации сахарозы в питательной среде: сначала до 10, потом до 15 и до 20% Затем клетки осаждали как в способе-прототипе и добавляли криопротектор, равный объем 40%-ного раствора сахарозы. Конечная концентрация сахарозы составила 30%, точка замерзания -2,4 С и температура дополнительного хладагента должна быть не выше -24 С. Для клеток женьшеня, предварительно подготовленных, хорошие результаты дает и другой криопротектор: смесь диметилсульфоксида и сахарозы, конечные концентрации которых 10 и 30% соответственно. Точка замерзания -5,9 С и температура дополнительного хладагента должна быть около -60 С. Остальные операции проводят, как в примере 1,Таким образом возможные отличия в проведении предлагаемого способа зависят от конкретных живых клеток или тканей, подлежащих криосохранению, и не касаются способа проведения затравки кристаллизации в процессе охлаждения.Согласно полученным данным, предлагаемый способ позволяет увеличить уровень жизнеспособности клеток по сравнению со способом-прототипом, а также гарантирует затравку всех ампул и ликвидирует возможность повреждения клеток и тканей в момент затравки сверхнизкой температурой хладагента и быстрорастущими кристаллами льда. Предлагаемым способом облегчается работа на программном замораживателе, н 9 способ можно использовать и без этого аппарата: в таких случаях применяют поэтапное замораживание с помощью нескольких холодовых шкафов или смесей, имеющих различные отрицательные температуры и обеспечивающих охлаждениедо - (40-70) С с непостоянной скоростью. Такое охлаждение дает худшие результаты, но позволяет обойтись простыми приспособлениями,