Способ получения модифицирующих метилаз sso и sso

ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ьская-С адиента по льфата амм вьппающейся 100 от 0,3 ижающеися концентрацииния от 1,0 до 0,0 М иконцентрации тритонадо 0,602 и отборомветствюущих для Бяо 11осле хроматографии нае при концентрации триответственно 0,43 и2 табл. ракции, соодля Бяо 1енил-сефароона Хс,523, 2 ил. ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Научно-исследовательский институт медицинскойэнэимологии АМН СССР и Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И,Мечникова(56) Лопатина Н.Г. и др. Сайт-специфичность ДНК-метилаз из клеток БЬ).- ре 11 а воппе). 47. - Биохимия, 1985, т, 50, У 10, с, 1694-1701.Карташева И.М., Никольская И.И., Дебов С.СВыделение ферментов модиФикационного метилирования и рестрикции из БЬЦе 11 а воппеа 47. - Молекулярная генетика, микробиология и ви , русология, М., 1985, У 4, с. 31-35. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРУЮЩИХ МЕТИЛАЗ 88011 И 8801(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения сайт-специфических метилаз Бяо 11 иБяо 1. Изобретение позволяет получатьиз штамма БЬд 8 е 11 а яоппе 47 одновременно две модифицирующие. метилазыБяо 11 и Бяо 1, обладающий высокой стабильностью (более 12 мес). Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса, Способ предусматривает культивирование клеток 81)Це 11 а яоппе 1 47,их разрушение ультразвуком, центрифугирование при 105000 я, освобождениеот нуклеиновых кислот с помощью сульФата стрептомицина, высаливание белков сульфатом аммония (803 от насыщения) и проведение гидрофобной хроматографии иа фенил-сефарозе с использованием комбинированного линейногоИзобретение относится к микробиологии и генной инженерии и касаетсяспособа получения сайт-специфическихметилаз.Цель изобретения - упрощение и5ускорение процесса.Способ предусматривает замену глицерина на тритон Хповышающейсяконцентрации при гидрофобной хроматографии на фенил-сефароэе, отбор ферментов из соответствующих пиков активности и исключение стадии изозлектрофокусирования.П р и м е р 1. Клетки БЬе 11 а 15воппех 47 культивируют на бульонеХоттингера с добавлением 207 глюкозыдо достижения 10 млрд бактериальныхтел в мл при 37 СКлетки осаждаютцентрифугированием. Затем клетки суспендируют в рабочем буфере, рН 7,4,содержащем 20 мМ калий фосфата, 7 мМ-меркаптоэтанола и 1 мМ ЭДТА, и разрушают на ультразвуковом деэинтеграторе, Обломки клеток удаляют центрифугированием. в течение 1 ч при105000 я, Осадок отбрасывают. Надосадочная жидкость представляет собойгрубый экстракт. Освобождение от нуклеиновых кислот проводят с помощью 30сульфата стрептомицина, Осаждениебелков проводят сульфатом аммония80% от насыщения. Осадок растворяютв рабочем буфере, содержащем 1 Исульфата аммония и 0,3% тритона Х и наносят в количестве 10 мг белкаиа колонку размером 17 0,7 см с Фенил-сефарозой, уравновешенную тем жебуфером. Колонку промывают тремяобъемами буфера и Ферменты элюируютдвойным линейным градиентом понижающейся концентрации сульфата аммонияот 1 до 03 М и повышающейся концентрации тритона Хот 0,30 до 0,45%.Объем градиента 48 мл, Объем собираемой фракции 1 мл,При этом пик активности метилазыБзо 1 отсутствует, что показано нафиг. 1 и табл. 1,П р и м е р 2. Культивирование50клеток, их разрушение, получение грубого экстракта, освобождение от нуклеиновых кислот и высаливание белковсульфатом аммония ведут как в примере 1, Белок, нанесенный на колонку55с фенил-сефарозой, элюируют линейным градиентом концентрации сульфатааммония от 1 до 0 М и тритона Х от 0,30 до 0,607, Объем градиента 48 мл, объем однои фракции 1 мл. Вграциенте обнаруживается два пикаметилирующей активности Бво 11 и Бзо 1(см, фиг. 2 и табл. 1),Для стандартной процедуры выделения фермента был выбран пример 2.Пик активности метилазы Бзо 11 обнаруживается во фракциях градиента 1622 и элюируется с колонки 0,437. тритоном Х, а метилазы Бзо 1 - воФракциях градиента 25-37 и элюируется 0,52% тритоном Х, Предлагаемый способ позволяет эа 2 дня получитьферменты с удельной активностью7000 ед/мг белка, Ферментные препараоты хранятся при -10 С в течение 12 мес,(срок наблюдения) без потери активности (см, табл, 2). При получении препаратов Ферментов по прототипу метилазная активность сохранялась в течение 1-.2 сут, активность составляла3000-4000 ед/мг белка,За единицу активности принимащтколичество фермента, необходимое дляпереноса. 1 ршо 1 метильной группы Баденозилметионина на ДНК в течение1 мин при 37 С,Активность метилаз определяетсяс помощью радиоизотопного метода.Инкубационная смесь объемом 50 мклсодержит 8-10 мкг белка, 5 мкг акцепторной ДНК и 0,5 мкКи Н-БАИ, Пробыоинкубируют 1 ч при 37 С, наносят нафильтры СР/С, осаждают 20%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ), отмывают 5%-ного ТХУ и 70%-ным этанолом,высушивают и помещают в толуоловыйсцинтиллятор для подсчета радиоактивности.,оДля идентификации модифицирующих свойств ферментов реакцию метилирования проводят в инкубационной смеси объемом 100 мкл, содержащей 20 мкг ДНК Фага Ъ , 35-40 мкг белка, 2 икКиН-БАМ, Пробы инкубируют 24 ч при 37 С,Реакцию рестрикции проводят в инкубационной смеси объемом 50 мкл следующего состава: 0,1 И трис-НС 1 буфер, рН 7,4; 10 мИ ИС 1 , 1 мИ 1 -меркаптоэтанола; 5-7 ед, активности рестриктазы; 1 мкг ДНК фага Я (используется метилированная ДНК). Инокубацию ведут при 37 С 1 ч. Реакцию останавливают добавлением 5 мкл 507. - ного глицерина с 100 мМ ЭДТА и 0,57 бромфенолового синего, Рестриктаэнчотат;НСт," ттаРС. ттУК.:тт.ЕОТИДОтз чению из пооттесс а Очистки стадии Таблица 1 Условия получения препаратов Ферментов Бяо 11 и Бяо 1 Пример 1 Условия градиентного элюирования Полученный результат т соттцентравтия сул Фата аммония1-0,3 М етилаэа 8 яо 11 элюируетсяс 28 по 34 Фр, - 0,47тритоном Хк активности метилазы Яяо 1отсутствует Концентрация тритона Х 030-0,457 еттилаза Бяо 11 элюируетсяс 1 б по 22 фр. - 0,43% трито.ном ХКонцентрация сульфата аммония1-0 М Концентрация тритона Х0,30-0,б 07. 1 етилаэа Бяо 1 элюируется с25 по 37 Фр, - 0,52% тритоном Х3143 активность тестируют с помощью электрофореза в 0,87.-ном агарозном геле. Гель окращивяют раствором этидий бромида в концентрации 3 мкгттмп в течение 20 мин и Фотографируют в ультрафиолетовом свете при 254 нм с красным светоитсьтром.Препараты ферментов, полученные предложенным методом, не содержат экзо- и эндонуклеаз, на что ут;язывает полное сохранение ДПК Фага 7 т при длительной инкубации (24 ч) тзбыточных количе тв Ферментов (10-20 ед,) в условиях, способствующих действитол+ нуклеаз (в присутствии ионов Ир +). Это позволяет использовать метилязы 8 яо 1 и 8 ЗО 11 н экстсортптснтаО мо леку;тярпо-Оттотот ттттстс.кс;:ту ткоттс т Оуиттовапию рс:;От,бттттян тть.с т)К 1.п т 51 тсго.Сл"т " Отат.т т и ттсятттттосгь тте- тплазы 8 зо 1, кО гор; ю за счет тыостт.-. ДЕНПОС 55 Сайта УЭНЯПЯННЯ МСтжпо т; -пользовать не тО."5 ьео пля запттть НКСООТВЕТСтэтт,ЕО Т.:тиа РЕСТ 5 И 5 СЯЦ 5 П.,тто И ОТ ПЕЛтоО тнт:Я РС.СТРттКТСтэ СОЛЯдятт 51 тих схс 1 Н пт,";,тсятат Уз ттяв .тнттст5 тЕ;тЕСУттттсМ, 5551.ожДЕНПОСТтт тто ттС.тт Г 13 траттСжЕНПтт:; МЕТОДЕ СотразОНОчисло стадийвремя выделеИ Фер -метттотз 8 яс 11 и 8 ЗО 1 благодаря исклю 73944изоэлектрофокусирования, Способ может быть использован для получения метилаз 8 яо 11 и 8 яо 1, необходимых для экспериментов и практических работ по генной инженерии,Формула и э о б р е т е н и я Способ получения модифицирующихметилаз Яяо 11 и 8 яо 1, предусматривающий культивирование клеток бактерий 8 Ь 8 е 11 а яоппе ГИСК Р 172, раз-, рушение их ультразвуком, центрифугирование, освобождение от нуклеиновых кислот сульфатом аммония и гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе .стттбтт,тттров:. ттттттс линеспим градиентом Пот.тГтСЛЮтттсттСЯ КОНЦЕНТРЯЦИИ СУЧЬФЯТЯ ат тт тотт 5 От 1 1 до 0 ь 1 и повыюяющей ся сотцснтрапией элюента с элюцией БЗО 11 концентрацией сугтьфата аммония 0,58 11, я Бяа 1 - концентрацией сульфата аммония 0,37 М, о т л и ч а ю щй с я тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, гидрофобную КРСтыттТОГ 5 афттттэ НЯ ФЕНИЛ-СЕфаРОЗЕ ВЕ- .цУГ С ттснаттЗОВСтНИЕМ В КаЧЕСтВЕ ЭЛЮснтя повышающейся концентрации тритона Хот 30 до бО мас.Е, при1437394 Продолжение табл,1 Концентрация сульфата аммония1-0 М Концентрация тритона Х 0,30-0,653 Т а б л и ц а 2 Стабильность ферментных препаратов, полученных хроматографией на фенил-сефарозе, при хранениипри -10 С Срок хранения о 11 едлагаемый способ 100 3 мес,10, 6 мес мес ме 100 0 24 ч ивность в момент получения ферментов принята за 1002. 0 (момент получферментов) 0 (момент полученияферментов) 100звестный спо Метилаза Бво 11 элюируетсяс 16 по 22 фр. - 0,43 Х тритоном ХМетилаза Бао 1 элюируется с25 по 37 фр, - 0,523 тритоном Х100 100