Способ культивирования мицелиальных грибов продуцентов рибонуклеаз

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК х 45) ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ Н АВТОРСКОМУ С ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова АН СССР й Институт биохимии ии. А.Н. Баха АН СССР(56) Авторское свидетельство СССРй) 1008214, кл. С 08 3 9/261982Безбородова С.И. и др. Рибонуклеодеполимериэующая активность Аврег-.8111 цз с 1 ачайцв Вепш. Микология иФитопатология, 1969) т. 3, с. 518521. 4) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИЦЕЛИЬНЫХ ГРИБОВ-ПРОДУЦЕНТОВ РИВОНУЮБИ 51) 5 С 12 Я 9/22, 1/14// /(С 12 Н 9/22) С 12(57) Изобретение относится к прикладной.микробиологии, конкретно - к способу повышения продуктивности клеток, секретирующих рибонуклеазы (РНКазы). Изобретение может быть использовано в отраслях промышленности) производящих биохимические препараты, в также в научных исследованиях. Цель изобретения - повьппение выхода РНКаэ. Согласно изобретению, культуры грибов выращивают на агарнзованных средах до получения спорового материала. Споры иммобилизируют в криогеле 7,5- 153-ного поливинилового спирта (ПВС) путем замораживания суспензии спор в водном растворе ПВС при температуре от -10 до -40 С в течение 8-24 ч ф .с последующим раэмораживанием. Споры проращивают и культивируют в иммобилизованном состоянии в питательной . С среде, содержащей источник углерода, минеральные компоненты н воду. 1 табл.Изобретение относится к прикладной микробиологии, конкретно к спо"собам культивирования мицелиальныхгрибов, способных в определенных условиях секретировать во внеклеточнуюсреду ферменты, деполимеризующие рибонуклеиновые кислоты. Изобретениеможет быть использовано в отрасляхпромьпбленности, производящей биохимические препараты, а также в научныхисследованиях,Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.Изобретение осуществляют следующим образом.1. Получение спор мицелиальныхгрибов - культуры грибов выращиваютв течение 7-9 сут при 25-27 С на агаризованной среде состава, г/ 100 мл: 20сахароза 3,0; ИаИО 0,2, КН. РО 0,1;МАМБО 7 Н О 0,05, КС 1 0,05; РеБО 001;агар 2,0. Образовавшиеся споры смывают стерильной водой.2) Иммобилиэация спор в частицыкриогеля 7,5-15 Х-ного поливиниловогоспирта (ПВС) - зта стадия осуществляется приготовлением суспензии спорв водном растворе ПВС и замораживанием порций полученной суспензии приОтемпературе от -1 О до 40 С в тече"ние 8-24 ч с последующим раэмораживанием образцов. В результате получают частицы криогеля ПВС с иммобилизованными в них спорами того или иного мицелиального гриба,3) Проращивание спор - для этогочастицы криогеля ПЗС с включенными вних спорами помещают на 48-50 ч при25-27 С в питательную среду следующего состава, г/100 мл: глюкоза 5,0;соевая мука 050;пептон 1,0; КМО 0,2,ИяБО 7 НО0,05; СаС 1 2 НО 0,01.4) Инкубация иммобилизованных кле-ток в питательной среде - данная стадия может осуществляться как в реакторе стационарного режима с периодической сменой питательной среды,так и в реакторах проточного типаЧастицы криогеля ПВС с включеннымипроросшими клетками мицелиальногогриба-продуцента РНКаз загружают встерильный реактор (возможно такжепроращивание спор непосредственно втом же реакторе) и заливают питательной средой следующего состава,г/ 100 ил: глюкоза 5,0, (ЫН ) БО0,75; КИО, О,г; КНРО, 0.017;ИяБО7 НО 0,05", СаС 1 2 НО 0,02. В случае проточного реактора пита- тельную среду подают непрерывно. Культуральную жидкость (элюат иэ проточного реактора), содержащую секретированные иммобилиэованными клетками РНКаэы, собирают и далее обрабатывают известными приемами выделения н очистки целевых ферментов,Иммобилиэация не клеток мицелиального гриба, а его спор, позволяет, во-первых, равномерно распределить микроорганизмы в гелевом носителе, и, во-вторых, это дает воэможность не только сохранить биологи- . ческую активность клеток в иммобили. зованном виде, но и повысить их продуктивность в отношении секреции рибонуклеаэ.Применение в качестве носителя иммобилизованных клеток криогелей ПВС, обладающих развитой макропористой структурой, поэволяет, с одной стороны, легко прорастить споры мицелиального гриба после формирования частиц геля, а с другой " обеспечить живым клеткам благоприятные условия подвода питательных веществ и отвода метаболитов. При концентрации ПВС в криогеле ниже 7,57 механическая прочность частиц с включенными клетками мицелиальных грибов становится неудовлетворительной для реакторов с перемешиванием, а использование криогелей с концентрацией полимера выше 15 нецелесообразно иэ-эа боль" шого расхода гелеобразователя.Температура стадии иммобилизации спор мицелиальных грибов в криогели ПВС зависит от концентрации раствора полимера-гелеобраэователя, объема замораживаемых порций и имеющегося холодильного оборудования. В предлагаемом изобретении режимы данной стадии выбраны на основании экспериментов и составляют по температурео оот -10 до -40 , по времени - от 8 до 24 ч.Пленки поливинилового спирта не обеспечивают необходимой для прорастания мицелия макропористости; Сшитый посредством УФ-облучения гель ПВС также непригоден для выращивания микромицетов, т.к, при облучении устрачивалась способность конидий к прорастанию или наблюдалось снижение активности РНК-азы.Таким образом, криогель ЛВС по сравнению с другими способами иммобилизации обеспечивал оптимальные условия для жизнедеятельности мицелиальных грибов - продуцентов РНК-аэ.Состав питательных сред для полу 5чения спор мицелиальных грибов, дляпроращинания иммобилизонанных спори для секреции РНКаз иммобилиэованными проросшими клетками, а такжетемпература и продолжительность этихстадий определены экспериментально.Приводимые составы питательных среди условия процессов являются опти-.мальными для используемых микроорганизмов. 15Изобретение поясняется примерами.П р и и е р 1. Культуру грибаАарекя 111 ца с 1 ачакпа 229719 выращиовают при 25 С в течение 9 дне наагаризованной среде состава, 20г/100 мл: сахароза 3,0 ИаИО 0,2;КНРО 4, 0,1, М:.04 ф 7 Н О 0,05, КС 10,05; Ре 504 0,001, агар 2,0. Образо,вавшиеся споры смывают стерильнойводой и перемешивают смыв в течение5 мин в миксере, после чего доводятбконцентрацию опор до 4 10 спор намл жидкости с помощью стерильнойводы,5 мл водной суспенэии полученных 30спор смешивают с 45 г водного раст"вора ПВС, содержащего 3,75 г полимера. Порции полученной суспензии объеОмом по 250 мл замораживают при -10 Св течение 24 ч. После оттаивания полученные частицы 7,5 -ного криогеляПВС с включенными спорами промываюттрижды стерильной водой.Полученные частицы криогеля ПВС свключенными спорами помещают на 48 чопри 25 С н питательную среду состав,г/100 мл: глюкоза 5,0; соевая мука0,5, пептон 1,0; КНО 0,2; МАЗОк 7 Н О 0,05, СаС 12 Н О 0 01.Частицы криогеля с проросшимииммобилизонанными клетками помещаютв питательную среду состава,г/100 мл: глюкоза 5,0; (БН 4) 804075 КБО 0,2, КН 04 0,017 МВБО 4х 7 Н О 0,05, СаС 1 2 Н О 0,02. Инкубируют при 25 С в течение 12 сут,меняя среду через каждые три дня.Суммарный выход РНКазной активности эа 12 сут Функционирования иммобили-,эованных клеток составил 10250 ед.акт,на грамм сухого мицелия, в то времякак свободные клетки н тех же условиях были способны секретиронатьРНКаэы только в течение 3 сут, а суммарный выход РНКазной активности составил для них 1770 ед.акт, на граммсухого мицелияВ таблице представлены данные по.вьцсоду РНК"аз .в занисимости от продуцента и условий культивирования,Преимущества изобретения заключаютая в том, что поньппение выходаРНКаз достигается не эа счет трудоемкой селекции штаммов продуцента, аза счет увеличения сроков продуктивного функциониронания клеток, чтопозволяет получить хороший выходактивности РНКаэ даже н случае неочень активных штаммов (см. ВУ 5 и10 в табл,). Данное обстоятельствоважно в случае продуцентов, секретирующих РНКаэы с ценной для практических целей субстратной специФичностью,Улучшение технологичности процесса достигается как простотой отделения клеток от культуральной жидкости при смене среды в реакторах стационарного режима, так и непрерывностью процесса н случае использования реакторов проточного типа,Формула и э обретения Способ культивированиямицелиальных грибов - продуцентов рибонуклеаз, предусматринающий получение спороного материала продуцента, проращивание его и последующее глубинноекультивирование н питательной среде,содержащей источники углерода и, азота, минеральные соли и воду, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения выхода целевого про"дукта, спороный материал мицелиальных грибон перед проращиванием иммобилизуют в частицы криогеля поливини"лового спирта путем замораживания в7,5-15 -ном водном его растворе с последующим разморажинанием,5 14053106Выход РНК-аз в зависимости от продуцента и условийиммобилизации Продуцент .РНКазЭ Условия иммобилизации спорекреция РНКаз клетами продуцента и/и название итамм концентрацияПВС, Х температура замора иия,с и 1 а 97/ 10250 2 1275 1320-12 90 4 Свободные клетк б епсд 111 в сЬгуао 8 35 78 6 5 аепщп Аарет 8 И 1 цв с 1 ачаЫв а Аврей 811- 1 иа ра 11 ддив ба Реп 3.сд 111- пш Ьгеч- сошрас 1 ош 2283/н 7,510,0 10,12,фвремя замовремя инку- бации суммарная продуктивность1405310 Продолжение таблицы Продуцент РНКаэ екреция РНКаз клетами продуцента Ифп/п название штамм температура заморав живания,С б1782 И И И И 7650 160 ев ви аи ти вееав еще тититиащитти шае те тиеешииишаеее вщ тв ищ ае ищ йе аетСпособы культивирования продуцентов РНКаз: стационарный режим - 1 1 а, б, г; Эа, в; 4 а, б; 5 а, в; 6 б, в; 7 а, б; 8 а, в 1 9 а, б, 10 а, 6 и 11 а, в, культивирование в реакторе проточного типа - Ю 1 в, Эб, 5 б, ба, 8 б и 116.1 Составитель А.ВоробьеваТехред А.Кравчук Корректор Л.Пилипенко едактор А.Кондрахина Заказ 3092 ,тираж 489 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва Ж Раушская наб д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Условия иммобилизациис.спор концент- время рация замо- ПВС, Х раживания ч в Свободные клетки времяинкубации,сут. суммарная продуктивность