Способ определения общего холестерина в сыворотке крови

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК ЯО,48 Меллерирубер и мбХ (0 Е) а, Аса,тотип)ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССОРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ путем воздействия на пробу холестеринэстеразой с последующим измерением холестерина после обработки холестериноксидазой, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве холестеринэстераэы используют ацетоновый сухой порошок или обогащенную холестеринэстеразную фракцию микробной массы СапйИа гияова АТС С 14830 или ВЬ 16 орпз врес. (МЗ 90027), которую берут в соотношении10 ч. на 1 мл сыворотки..ойцзсайцзАсСдпошусезшусдпдАсСдпошусезрогцз-Е 1АсгдпошусезСосцаАсйдпошусез ацгеосуапеягдзео 1 опядзша 1 асМгозео 1 цз ЪБ 9000250ЪБ 90003 ЮБ 90004 МБ 90005 55 ЪБ 90006 ИБ 90007 Изобретение относится к области медицины,именно к способу опреде- ления общего холестерина или свя" эанного холестерина в сыворотке крови. 5Известен способ определения общего холестерина в сыворотке крови путем воздействия на пробу холестеринэстераэой с последующим измерением холестерина после обработки холес теринэстераэой 1 .Цель изобретения - повышение точности определения.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определе ния общего холестерина в сыворотке крови путем воздействия на пробу холестеринэстеразой с последующим измерением холестерина после обработки холестеринэстеразой, в ка честве холестеринэстеразы используют ацетоновый сухой порошок или обогащенную холестеринэстераэную фракцию микробной массы Саподоа гц 8 оза АТС С 14830 или Кпдзорцз зрес. (МС 25 90027), которую берут в соотношении 1 - 10 ч. на 1 мл сыворотки.Способ осуществляют следующим образом;Используют холестеринэстеразу из З 0 СапйИа гцяоза (называемой также ,Су 1 дпдгасеа) АТСС 14830 или ИС 90031 и Азрегяд 11 цз зрес. УЯ 90030. Оба эти микроорганизма могут применяться непосредственно или в растворенной форме, например, как ацетоновый сухой порошок. Возможно применение препарата, насыщенного холестеринэстеразой, из этих микроорганизмов, причем преимущественно состоит в том, что простым путем можно достичь определенного насыщения, Обычная форма представляет собой стабилизированный лактозой ацетоновый сухой порошок. Подобные благоприятные свайства найдены у следующих препаратов:Наряду с предпочтительными холестеринэстераэами микробиологическогопроисхождения могут применяться .также холестерннэстераэы другого происхождения.Преимущество способа сосотоит втом, что возможно полное ферментатив"ное определение общего холестерина. При этом имеет значение то, что припомощи препаратов холестеринэстераэы из микроорганизмов возможно быстрое и количественное освобождение холестерина из его сложных эфиров.В частности, при помощи указанныхмикроорганизмов можно добавлениемпоследних достигнуть в течение нескольких минут количественного высвобождения холестерина, Установлено,что обычные стабилизаторы на основеуглевода, которые применяют длятаких микроорганизмов, в рамкахферментативного способа определенияхолестерина не влияют на результатопределения,Для осуществления способа можноприменять обогащенную холестеринэстераэу, преимущественно иэ микроАсдпошусез гохуггдсдпдАсйдпошусез чагдаЬд 1 дзБггерошусез зрес. БггерСовусез ацйо" ггорМсцзБйгерговусез сапезсепзБсгерсовусез сЬагГ- гецздзБСгергошусез вдсЬдяапепздзБсгерсовусез вцгдпцз Бсгерговусез ЬасЬд,1 оепздзБггерйовусез сае 1 езгезБггерйовусез гепйае Иосагдда гцЬга Саппдпа вусодегепа Сапцдоа а 1 Ьдсапз Сапйдйа а 1 Ьдсапз СапдЫа а 1 Ьдсапз Сапддца зрес.СцппдпдЬаве 11 а е 1 еяапзИцсог вцседоКЬдеорцз зрес. Репдсд 11 дцв. зрес. Азрегяд 11 цз зрес. ЪБ 90008 ИБ 90009 ЪБ 90010 ЪБ 90011 ЪГБ 90012 ЪБ 90013 ИБ 90014 ИБ 90015 ЪБ 90016ИЯ 90017 ИБ 90018 ЪБ 90019 УЯ 90020 ИЯ 90021 ИБ 90022 УЯ 90023 ИЯ 90024ИБ 90025 ИЯ 90026 ЪБ 90027 ЪБ 90028 ИЯ 90029з 1168организмов. Соответствующее обога- ф.щение можно достигнуть исходя изацетонового сухого порошка микроорганизма или другого биологическогоматериала, подвергая его диализу,обработке слабоосновной.анионообменной смолой и фракционированию ссульфатом аммония. Таким путем легкодостигают 20-30-кратное обогащениехолестеринэстеразы.Особенно благоприятные результаты получены с микроорганизмами, которые выращивались на содержащейхолестериновый эфир питательной среде. При этом холестериновый эфир 5или смесь холестериновых эфировможет добавляться во время выращивания как единственный источник углерода или применяться вместе с другимисточником углерода. Особенно предпочтительны микроорганизмы, которыеполучены многостадийным способомкультивирования, причем они культивируются в первой стадии на соответствующем поставщике углерода, 2 Зкак глицерин, и во второй стадии нахолестериновом эфире.Холестеринэстераэа иэ СапдЫагцдоза АТСС 14830 имеет в слабокислой области между рН 5 и 6,5очень хорошую стойкость. Оптимум рНфермента 7,5. Характерная особенностьфермента заключается в том, что особенно каталитическая реакция происходит при сравнительно высоком содер 35жанни соли в реакционной среде.Поэтому преимущественно работают сбуферным раствором 0,2-0,8 И, особенно 0,4-0,6 М. Величина рН можетбыть 4,5-7,5, преимущественно 5-6,5.Активность холестеринэстеразы повышается при добавлении поверхностно-активных веществ, особенно гидро"ксиполиэтоксидодекана.Последующее определение холестерина производят ферментативно, .яреимущественно с применением холестериноксидазы. Можно применять. такжехолестериндегидраэу или холестериндегидрогеназу.0Определение посредством холестериноксидазы по известному способуможно комбинировать с данным способом, При этом можно измерять расходкислорода, образование Н 20 илиобразование холестенона,Расход кислорода можно определять,например методом газовой хроматогра 103 4фин, полярометрическим или поляризационным методами. Образованную перекись водорода можно определять титрометрическим, потенциометрическим, полярографическим и колориметрическим методами, а также ферментативным. Предпочтительно ферментативное определение с применением каталазы или пероксидазы, особенно определение посредством каталазы в присутствии ф -дикетонов, как ацетилацетон,низших спиртов и содержащего ионы аммония буферного раствора, илн определение посредством пероксидазы в присутствии хромогена, как 2,2 -аминобензтиазолинсульфокислота, Холестенон определяется при помо- щи кетореактивов, например 2,4-динитрофенилгидразина, или фотометрическим методом при 240 нм.П р и м е р 1. В сыворотке с применением известного способа определяют содержание свободного хопестерина 63 мг Е (63 мг в 100 мл). Для определения связанного холестерина сравнительную пробу сывороткиообрабатывают при 70 С раствором едкого кали в спирте, После нейтрализации и повторного измерения имеющегося холестерина получают общее содержание холестерина 181 мг Х. Отсюда следует, что 18 мг холестерина 100 мл были в связанной форме.Способ повторялся с необработан-. ной сывороткой, однако к началу определения добавляли 0,3 мг (в пересчете на протеин) СапйЫа гцяоза АТСС 14830 - сухого,ацетонового поро. шка в торговой форме. Через 3 мин полярографическое определение показало содержание общего холестерина 183 мг 7П р и м е р 2. Для увеличения активности холестеринэстеразы аце-. тоновый сухой порошок СапйЫа гцова АТСС"14830 растворяют в буферном растворе с фосфатом калия при рН 6,0 и подвергают диализу относительно того же буферного раствора. После удаления содержащейся в качестве стабилизатора.лактоэы в подвергнутом диализу растворе получают специфическую активность холестеринэстеразы 0,3 ед 7 мг протеина.Полученньщ таким путем раствор смешивают с модифицированными группами диэтиламюноэтанола ионообменником на основе декстрана, ионит5 1 Ь 15 25 ЗЬ Э 5 46 4 отделяют и элюируют при помощи 0,2 М буферного фосфатного раствора при рН 6,0. В элюате получают специфическую активность холестеринэстеразы 1,2 ед/мг.Полученный таким путем раствор . подвергают фракционированию с сульфатом аммония. Осаждающую протеиновую фракцию между 1,8 и 2,4 М сульфатом аммония отделяют. Она имеет сйецифическую активность холестерин-. эстеразц 2,5 ед/мг.Полученный таким образом продукт снова растворяют в фосфатном буферном растворе с рН 6,0, подвергают диалиэу относительно того же буферного раствора до удаления соли и затем хроматографируют на колонне, заполненной такой же аниоиообменной смолой, как указано. Снова производят элюирование посредством 0,2 М фосфатного буферного раствора с рН 6,0. Во фракции с активностью хо, лестеринэстеразы получают специфцчес кую активность 7 ед/мг протеина.Полученный таким путем обогащенный препарат холестеринэстеразц применяют для определения холестерина. Однако введенное количество только 0,001 мг в пересчете на протеин. Результат соответствовал примеру 1.П,р и м е р 3. К 0,5 мл сыворотки или холестеринового эталонадобавляют 1,0 мл 0,5 М буферногораствора с фосфатом калия при рН7,5, который содержит 04 Х гидроксиполиэтоксидодекана, и 2,5 ед холестеринэстеразы по примеру 2, Зтареакционная смесь инкубируется втечение 40 мин при 37 С, После этого 0,25 мл этого раствора добавляютк 3 мл холестеринового реактива,который содержит 2 ч. уксусной кислоты, 3 ч, уксусного ангидрида и1 ч. серной кислоты (реактив Либермана-Вурхардта) .Используя эталон как сравнительную величину, для типичной пробы находят 170. мгй общего холестерина.Сравнительное .определение при омылении холестериновых эфиров посредством раствора едкого кали вспирте дает величину 165 мг 7П р и м е р 4, 0,02 мл сыворотки смешивают с 10 мп 0,5 М буферного раствора с фосфатом кальция, который содержит 0,4 Х гидрокси. полиэтоксидодекана, и 0,2 ед холестеринэстеразы по примеру 2. Реакционныф раствор инкубируют 60 мин при 37"С. После этого определяют экстинкцию (Е 1) при 240 нм по показаниям соответствующего спектрофотометра, реакция начиналась с 0,1 ед стериндегидразы из ВгечдЬасйегъиш . зСего 1 сцш. Через 15 мин снова считывают по прибору экстинкцию (Е,). Концентрация образованного Ь -холестенона и холестерина полу" чается из разности между первым и вторым отсчетом, учитывая молярный коэффициент экстинкции для А -хоелестенона при 240 нм. Измерение, типичной пробы показало 183 мг 7. общего холестерина. Сравнительное определение с холестериноксидазой (из Мосагд 1 а егуйЬгоро 11 з) вместо стериндегидразы давало 181 мг 7. общего холестерина. П р и и е р 5. 10 г диаммонийгидрофосфата растворяют в 100 мл воды и при помощи 857-ной фосфорной кислоты устанавливают величину рН 7,0. Затем добавляют 10 ед ката- лазы. Полученным таким путем раствором доливают до 100 мл смесь 0,2 мл ацетилацетона, 10 мл метанола и О, 1 г гидроксиполиэтоксицодекана. В этот раствор добавляется 2,5 ед холестеринэстеразы из Кп- горцз зрес. (ИБ 90027),5,0 мл полученного таким путем раствора смешивают с 0,02 мл сыворотки или 0,02 мл холестеринового эталонного раствора с содержанием 200 мгХ холестерина. Делящиеся беэ остатка количества содержащей сыворотку и содержащей холестериновый эталонный раствор пробы смешивают каждое с О, 1 ед холестериноксидазы и инкубируют 60 мин при 37 С. Затеме красящее вещество измеряют при 405 нм фотометром, учитывая холостую величину пробы. Содержание холестерина в содержащей сыворотку пробе, учитывая эталон как сравнительную величину, 154 мгХ всего холестерина. Контрольное определение посредством холестеринэстеразы из СапйЫа гатова АТСС 14830 вместо холестеринэстеразы из Ипгорцз зрес. (ИЯ 90027) давало такую.же величину.1168103 8кости, при этом возможно определениехолестерина связанного в сложныеэфиры. Составитель Н. ХрусталеваРедактор О. Колесникова Техред А.Кикемезей Заказ 4447/56 Тираж.897 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 11303/, Москва, Ж-.З/, Раувская наб., д.а(/Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 7Способ позволяет быстро и.точно определить содержащее связанного холестерина в биологической жидКорректор 1 И, Самборскаа 1Подписное