Способ получения липосом

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 5709 н) С 11 В 1/10 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ,Н.Семенко Черенкевич а Трудовог арственный нина ни госу В.И.Л.8) Л "Вз.973, 5 Ьев. Вор Ьуз. Нф 1, 224-230. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) БелоруссКрасного Знамуниверситет нм09 1 1165 7Изобретение относится к химичес" кой технологии высокомолекулярных соединений, конкретно к способу получения липосом, и может быть использовано в химической промышленности и медицине, а также в научно-исследовательских и учебных лабораториях для получения в аналитических и препаративных целях липосом из липидов растительного и животного происхожде. 1 О ния.Целью изобретения является повышение устойчивости липосом к действию Физико-химических ФакторовП р и м е р 1. Липосомы пригото вили следующим образом, 1,5 мл 103- ного спиртового раствора лецитина яичного желтка подвергли вакуумной - сушке, суспендировали в 5 мл дистиллированной воды, Полученную суспен р зию обработали озоном концентрации 50 мг/м в течение 20 мин и провели зкстракцию хлороФормом в отношении 1:1. Затем хлороФормрастворимую Фракцию подвергли вакуумной сушке, пере вели в водную Фазу р 11 6,0 и обработали ультразвуком мощностью 5 Вт/см в течение 5 мнн в режиме стоячих волн.Образование липосом контролировали с помощью методов светорассеяния и электронной микроскопии.Данный метод пригоден для приго" товлепия .устойчивых липосом из липидов как,растительного, так и живот 35 ного происхождения.П р и м е р 2. На флуориметре измеряли интенсивность люминесценции при =460 нм липосом, полученных по примеру 1 и липосом получен 4 р ных известным способом, в зависимости от сроков хранения при естественном освещении в комнатных условиях. В табл. 1 представлен сравнительный анализ изменения интенсивности Флуоресценции (1=460 нм) липосом, полученных предлагаемым (1) и известным (1) способами.в процессе хранения. при комнатной температуре (А), при действии температуры (Б), 5 р при действии УФ-излучения .(В), при действии перекиси водорода (Г).Из табл. 1(А) видно, что интенсивность люминесценции липосом, полученных известным способом (контрольные липосомы), растет со временем хранения, что свидетельствуют об увеличении концентрации продуктов окисления липидов в данных липосомах и,следовательно, об увеличении степениокисленности самих липосом. В то жевремя интенсивность люминесценциилипосом, полученных предлагаемымспособом, остается практически постоянной, т,е. липиды в них окисляются в течение длительного срока хранения, следовательно, сами липосомыболее устойчивы к длительному хранению.П р и м е р 3. Последовательностьопераций такая же, как в примере 1 .Концентрация озона 50 мг/м, времяозонирования 20 мин. Измеряли интенсивность Флуоресценции липосом при,Полученные результаты представленыв табл. 1 (Б), откуда следует, чтопри повышении температуры интенсивность Флоуресценции контрольных липосом растет, что свидетельствует обувеличении степени окисления липидовв липосомах, следовательно, и самихлипосом. Для липосом, полученныхпредлагаемым способом, интенсивностьФлуоресценции практически не изменяется при повышении температуры и сохраняется устойчивость даже на 30 сутки хранения при 60 ОС, в то времякак контрольные липосомы практическиполностью разрушены.П р и м е р 4. Последовательностьопераций такая же, как в примере 1,Концентрация озона 5 мг/м, времяоэонирования 30 мин. Липосомы подвергли действию Уф-излучения от лам-пы ДКСШв течение 10 мин, а затем измеряли интенсивность флуоресценции через 0 ч, 1 ч, 1 сут,.10 сут30 сут после действия УФ-излучения.Полученные результаты представленыв табл, 1 (В),Из сравнения результатов видно,что интенсивность флуоресценции липосом, полученных предлагаемых способом и подвергшихся действию Уф-излучения, практически не меняется.в течение 30 сут, в то время какстепень окисленности контрольныхлипосом значительно увеличиваетсясо временем хранения,Таким образом, липосомы, полученные предлагаемым способом, являются более устОйчивыми к воздействию УФ-излучения.П р и м е р 5, Последовательность операций осуществляли, как в приме709 з 1165ре 1. При получении липосом озонирование осуществляли в течение 5 минс концентрацией озона 100 мг/м,К липосомам добавляли перекись водорода (концентрация перекиси водородав суспензии липосом 0,57). Измеряли .интенсивность флуоресценции через0 ч, 1 ч, 1 сут, 10 сут, 30 сутпосле добавления перекиси водорода.Полученные результаты представле Оны в табл. 1 (Г). Из сравнения результатов следует, что липосомы, полученные предлагаемым способом болееустойчивы к.перекисному окислению.Интенсивность флуоресценции липосом при 3=460 нм характеризует устойчивость к внешним воздействиям химического состава соединений, в частности липидов, образующих липосомы.Наличие и устойчивость липосомы как 2 оцелого характеризует интенсивностьФсветопропускания при 3=6327 А и потенциал электрического пробоя.П р и м е р 6, Для измерения интенсивности светопропускания при Д= Иф=6327 А на нефелометре был осуществлен последовательно ряд экспериментов, аналогичных примерам 2-5.В табл, 2 представлен сравнительный анализ измерения интенсивностисветопропускания при 3=6327 А липосом, полученных предлагаемым (Хь)и известным (1) способами, в процес"се хранений при комнатной температуре (А), при действии температуры (Б)при действии УФ-излучения (В), при ,:,действии перекиси водорода (Г).Из табл. 2 следует, что липосомы,полученные известньв способом, принагревании до 60 С сохраняют свою . 4 Оустойчивость не более 10 дней, в товремя как липосомы, полученные предлагаемым способом, сохраняют свою .устойчивость 30 сут и более.При Уф-воздействии на 30 суткисохраняют устойчивость 557, лицосом,полученных известным способом, и 953липосом, полученных предлагаемымспособом. Аналогичная тенденция сохраняется и при воздействии перекисИ бводорода. Из этого следует, что липосомы, полученные предлагаемым способом, являются более устойчивыми, чем контрольные липосомы. П р и м е р 7. Для оценки устойчивости к прикладываемому электрическому напряжению измерен потенциал пробоя фрагментов липосом, полученных известным и предлагаемым способами при длительном хранении.В табл. 3 представлен сравнительный анализ изменения потенциала прибоя фрагментов липосом, полученных предлагаемым (0) и известным (Пк) способами в процессе хранения, откуда следует, что потенциал пробоя, а следовательно, и устойчивостЬ липо" сом, полученных предлагаемым способом втрое выше липосом, полученных иэ" вестным способом.П р и м е р 8. На практике асто возникает необходимость использования липосом для "упаковки" (включения внутрь липосомы) легкоразрушаемых биологически .активных веществ (микро,капсулирование) с целью длительного хранения. Невысокая устойчивость липосом, получаемых известными способа-. ми, не позволяет защищать от окисле-. "ния биологически активные вещества более чем на 100 мин. Липосомы, поду" ченные предлагаемым способом, защицают от окисления биологически активные вещества в течение 600 мин и более.В табл, 4 приведены значения оптических плотностей поглощения полиенового антибиотика айфотерицина В (гептаен) при 1=412 нм, заключенного в ли посомы, полученные предлагаемым Э и известным О, способами.Значительное снижение оптической плотности гептаена в липосомах, полученных известным способом,свидетельствует о значительной степени окисленности этого вещества, что обусловлено низкой устойчивостью укаэанных липосом по сравнению с липосомами, полученными предлагаемым способом.0 ч 1 ч 1 сут 30 сут. 10 сут Потенциал 270 270 90 100 Ч (мВ)(мВ) 290 270 290 90 120 130 Таблица 4 Оптическая плотность 0 мин 10 .мин 30 мин 100 мин 0,89 0,15 1,0 0,95 0,98 1,0 0,40 0,65 0,95 0,80 Способ получения липосом Количество разрушенныхлипосомЕ Нагрева- Уф-облучениение Предлагаемый Концентрацияозона 10 мг/м 5 Время озонпрования 5 мин Концентрацияозона 5 мг/м 17 . 23 Время еэонирования 2 мин 32 Известный П р и м е р 9. При получении липосом осуществляли озонирование липидов при следующих условиях: концент рация озона 100 мг/м, время озонирования 30 мин; концентрация озона 200 мг/м, время оэонирования 40 мин.Выделяли хлороформрастворимую фракцию выход которой определяли взвеши- З 0 ванием, При использовании запредеьных значений озонирования выход хлороформрастворимой фракции уменьшился на 507 а следовательно, количество . получаемых липосом уменьшается также вдвое.Следовательно, озонирование липидов в концентрации выше 100 мг/м в течение времени больше 30 миннецелесообразно, так как приводит, щ к значительному снижению выхода липо(сом. П р и м е р 10, Получали липосомы: при следующих условиях: концентрация 1 озона 10 мг/м, время озонирования 5 мин (нижний граничный предел);концентрация озона 5 мгНм, время озонирования 2 мин (нижнее запредельное значение). Сравнивали полученные предлагаемым способом липосомы с липосомами, полученными известным способом, на устойчивость к нагреванию (й =60 С в течение 20 ч) и УФ-облучению (лам"55 па ДКСШв течение 40 мин)методами светорассеяния и люминесценции, Полученные результаты представлены в табл. 5,Т а б л и ц а 5 Из табл, 5 видно, что использование концентрации озона ниже 10 мг/мф и времени озонирования меньше 5 мин нецелесообразно, так как устойчивость получаемых липосом,значительно снижаатся,