Способ диагностики хронического гепатита

союз советснихОПЭВЛЮЩЕСиниРЕСПУБЛИК 91 (111 150 А 61 В 10 00 Ь 01 Н 33 4 ТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ГОСПО ДЕ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ В 36Е.Э.Завадскамирнова пато(21) 3462907/28-13(56) 1. Блюгер А.Ф. Основы гелогии, Рига, "Медицина", 1975,с. 124-126,(54)(57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА путем исследованияткани печени, о т л и ч а ю щ и й -с я тем, что, с целью ранней диагностики, ткань печени разделяют наизолированные клетки последовательной обработкой ее фосфатными буферамис рН 7,8+0,2 в течение 18-22 мин ис рН 7,2+0,02 в течение 13-15 мин,далее в изолированных клетках определяют содержание гликогена и приувеличении его в сравнении с нормойдиагностируют хронический гепатит.Изобретение относится к медицине,преимущественно диагностике заболеваний и непосредственно к диагностикехронического гепатита.Известен способ диагностики гепатита путем исследования .ткани печени,заключающийся но взятии материалаткани печени с помощью пункционнойбиопсии, приготовлении и гистологической обработке препарата и установ Оленин заболевания по состоянию тканипечени 13.Этот способ позволяет установитьформу заболевания в целом и лишь грубо оценить его степень только при 15сильно выраженном либо далеко зашедшем процессе, Проводить раннююи точную диагностику заболевания,а также оценить степень его тяжестис достаточной чувствительностью 20этот способ также не позволяет. Этообусловлено тем, что первоначальнопоражение охватывает отдельные клет-ки паренхимы печени и лишь позднееткань и орган в целом, что выражается прежде всего в тонких изменениях структуры клеток и содержаниив них различных компонентов. Прислабо выраженных персистирующих формах хронического гепатита признакизаболевания также наиболее выраженылишь на клеточном уровне, что невозможно установить стандартной качественной гистологической методикой,Целью изобретения является повышение точности диагностики.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу диагностики хронического гепатита путем исследования ткани печени, ткань печени раз 4 Оделяют на изолированные клетки последовательной обработкой ее фосфатными буферами с рН 7,8+0,02 в течение 18-22 мин и с рН 7,2+ 0,02в течение 13-15 мин, далее в изолированных клетках определяют содержание гликогена и при увеличении егов сравнении с нормой диагностируютхронический гепатит.Способ осуществляют следующим образом.Ткань биопсийного материала последовательно обрабатывают двумяфосфатными буферами: первым с рН7,8+0,02 в течение 18-22 мин и вторым с рН 7,2+0,02 в течение 1315 мин. Затем из кусочков, взятыхиз второго буфера, приготавливают мазки живых изолированных клеток, которые фиксируют абсолютным метанолом. На полученных препаратахмазках определяют относительное содержание гликогена в клетках с помощью известного цитофлуориметрического метода включающего Флуоресцентную РА-реакцию с последующей цитофлуориметрией гликогена; при этом флуоресцентную РА-реакцию с последующей цитофлуориметрией гликогена ставят на трех препаратах диагносцируемого материала и одном эталонном с известным содержанием гликогена, После этого устанавливают абсолютное содержание гликогена в клетках диагносцируемого материала путем сравнения относительных результатов, полученных на диагносцируемых и эталонном препаратах При увеличении содержания гликогена в клетках диагносцируемого материала по сравнению с нормой диагностируют гепатит.При этом мазки живых изолированных клеток приготавливают путем перемещения капли взвеси;их на предметные стекла и разнесения каждой капли по предметному стеклу с помощью кварцевого стекла со шливованным краем.В качестве эталонного препарата используют неокрашенный препаратмаэок фиксированных изолированных клеток печени с известным содержанием гликогена в граммах, который получен от лабораторного животного. После одновременной цитофлуориметрической обработки эталонного препарата с тремя диагносцируемыми в последних определяют содержание гликогена по формуле10д(КПК)где- содержание гликогена в клетках печени человека, г; Э(КЛЧ) - интенсивность флуоресценции клеток печени человека(усл.ед.);2 сР(КПК) - интенсивность флуоресценции клеток печени лабораторного животного, обработанных параллельно с клетками печени человека (усл.ед,);д - содержание гликогена в эталонном препарате клеток печени лабораторного животного г.Операцию по изоляции клеток из ткани печени путем последовательной обработки материала фосфатными буферами проводят только на живых клетках, что позволяет длительно сохранить их неповрежденными и получить точные панные цитофлуориметрического анализа.Сравнение диагносцируемого материала с эталонным препаратом, в О котором известно содержание гликогена в граммах, необходимо для получения результатов в абсолютных единицах,П р и м е р. Донор, 28 лет, по ступил в больницу по поводу носительства Н + (антиген вирусного гепатита) для обследования, При обследовании функциональные биохимические пробы оказались в пределах нор мы.Была проведена пункционная биопсия. Получено около 10 мг материала ткани печени. Половина этого материала была отправлена в клини ческую лабораторию для приготовления и немедленной обработки препаратов гистологическими методами. Другая половина была немедленно30 подвергнута количественному анализу на содержание гликогена в клетках с применением цитофлуориметрического метода, и полученные результаты абсолютного содержания гликогена были сопоставлены со стандартными показателями степени поражения лев чеки согласно разработанному способу. Для этого кусочек ткани печени помещали в стеклянный бюкс объемом 10 мл с первым фосфатным буфером рН 7,8,40 где выдерживали в течение 18 мин. После этого глазными ножницами кусочки разрезали на несколько частей и помещали во второй фосфатный буфер с рН 7,2 в другом бюксе 45 того же объема. По истечении 13 мин из кусочков приготавливали мазки живых изолированных клеток. Пля этого малым глазным пинцетом извлекали каждый обработанный кусочек и выделяли из него живые изолированные клетки в каплю второго фосфатного буфера на поверхности предметного стекла путем осторожного потряхивания кусочка с помощью пинцета. За тем получечную взвесь живых изолированных клеток разносили по поверх. ности предметного стекла с помощью тонкого кварцевого стекла с ровным шлифованным краем. Для этого осторожно прикладывали к капле взвеси шлифованный край кварцевого стекла и быстрым, но плавным движением проводили им по всему стеклу. Фиксациямазка производилась немедленно путем нанесения капли абсолютного мета " иола пипеткой на предметное стеклос мазком живых изолированных клеток печени. Фиксированный таким образом мазок высушивали на воздухе. Общая продолжительность указанных операций составила 40 мин. Было получено 10 препаратов-мазков изолированных клеток печени. На трех препаратах полученного диагносцируемого материала провели флуоресцентную РА-реакцию, Продолжительность реакции при стандартных режимах 4 ч, Вместе с тремя препаратами диагносцируемого материала флуоресцентную РА-реакцию проводили еще и на эталонном одном препарате-мазке изолированных клеток печенилабораторного животного с известным содержанием гликогена в граммах на 1 клетку печени.Указанный эталонный препарат был взят невыборочно из серии 100 таких неокрашенных препаратов, которые предварительно быпи приготовлены следующим образом. Первоначально приготавливали препараты микрокапель 1 Е-ного раствора гликогена, микрокапли покрывали акриловым клеем, картировали и определяли в них количество гликогена в граммах с помощью интерференционного микроско - па марки МБИН. Затем приготавливали собственно эталонные препараты- мазки, для чего производили перфузию печени нормальной крысы смесью 1/15 М фосфатного буфера с рН 8 и 5 Х сахаровы (1:1) в течение 10 мин. После этого из перфузированной печени крысы вырезали небольшие кусочки, которые помещали в другой 1/15 М фосфатный буфер с рН 7,3 и там выдерживали в течение 8 мин. Из обработанных таким образом кусочков печени крысы приготавливали 100 препаратовмазков изолированных клеток по указанной методике. Содержание гликогена на эталонном препарате, а именно в клетках печени крысы, устанавливали путем одновременного цитофлуориметрического определения гликогена на.трех препара 1115722тах микрокапель 17-ного раствора гпикогена и на трех из 100 эталонных пр препаратах-мазках из расчета по формулеУ = - . - 10 г,Х 3 у где 9 - среднее содержание гликогенана 1 клетку печени данноголабораторного животного(крысы);содержание гликогена в микрокаплях гликогена, определенное интерферометрически, г;3, - интенсивность флуоресценциимикрокапель гликогена с известным его содержанием окраскфлуоресцентной РА-реакцией;3 - средняя интенсивность флуореценции клеток печени данноголабораторного животного, обработанных флуоресцентнойРА 5 -реакцией и измеренныхс помощью цитофлуориметрииодновременно с препаратоммикрокапель гликогена.Расчетами по этой формуле установлено, что среднее содержание гликогена на одну клетку печени крысы на эталонном препарате составило 24310г,После установления содержания гликогена на эталонных препаратах из оставшихся 97 неокрашенных эталонных был выборочно взят один, который и использовали для сравнениятремя препаратами диагносцируемого материала. Цитофлуориметрию гликогена на трех препаратах диагносцируемого материала и одновременно на одном эталонном после проведения на них флуоресцентной РА-реакции производили на опытном образце микрофлуориметра. Цитофлуориметрию препаратов производили в течение 3 ч, в результате была оценена интенсивность флуоресценции 700 изолированных клеток печени больного и для сравнения 300 изолированных клеток печени на эталонном препарате. Результаты измерений обрабатывали статистически на ЭВМ. При обработке данных учитывались показатели эталона микрокапель гликогена и данные указанного биологического препарата-эталона, что в целом позволило контролировать условия всех операций цитофлуориметрического анализа. Каждый из 700 измеренньгх показателей интенсивности флуоресценции клеток больного сопоставляли со средним показателем5 каждого эталона-препарата. Среднееабсолютное содержание гликогена на 1 клетку печени больного было определено по формулеЗ, (КПЧ)Х а10 г,д,(КПК)где 1 - содержание гликогена в клетках печени человека, г;152 (КПЧ) - интенсивность флуоресценции клеток печени человека,усл,ед.;З,г,(КПК) - интенсивность флуоресценции клеток печени лабораторного животного, обработанных параллельно с клеткамипечени человека, усл,ед,а - содержание гликогена в эталонном препарате клеток печени лабораторного животного,г.Этими расчетами установлено, чтоу больного содержание гликогена вклетках печени соответствует (203,1+6,9)ф 10 г. Диагностика и определел 2.ние степени тяжести хронического гепатита у больного проведены путемсопротивления этих показателейс установленными ранее стандартнымипоказателями степени тяжести поражения печени на массовом статистическидостоверном клиническом материале,Эти показатели представлены в таблицеВ результате было установлено,что повреждение клеток печени соотщо ветствует средней степени по вьпдеприведенным показателям, что отражает среднюю тяжесть хронического гепатита,Результаты исследования другого 45кусочка из того же биопсийного материала были получены через 7 сут послебиопсии. Диагноз по этой методике(прототипу 1 после сопоставленияс результатами клинико-биохимического анализа был следующий: у больногодостоверных признаков вирусного гепагита не обнаружено, имеются признакивирусного поражения части печеночныхклеток, указано, что исследованиенеобходимо повторить.55Через некоторое время больнойвновь поступил в больницу с симптомами гепатита - ноющие боли в областипечени, слабость, отсутствие аппеСреднее содержание гликогена в изолированных клетках печени человека,10г Степень поражения Норма слабая 267019+12, 12Заказ 6803/3 Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент",. г. Ужгород, ул. Проектная, 4 7 1 тита и т.п. Биохимические показатели и протеинограмма близкие к норме (исключая легкое.повьппение билирубина). Окончательный диагноз - хронический персистирующий вирусный гепатит,Таким образом, применение предлагаемогь способа в случае даже однократной биопсии позволило диагносцировать хронический гепатит у больного и определить среднюю степень тяжести его заболевания. При использовании комплексного клинического метода диагностики, включающего в себя и способ-прототип, сходный диагноз был установлен на 17 дней позже. 115722 8 Использование предлагаемого способа диагностики хронического гепатита позволяет по сравнению с извест.ными повысить точность диагностики 5 за счет оценки степени тяжести заболевания по объективным количествен ным показателям состояния специализированной функции печени на клеточном уровне; установить более раннюю 1 О диагностику за счет повьппения чувствительности способа, а также за счет ускорения его технологии по сравнению с прототипом; повысить надежность диагностики благодаря 15 возможности использования ЗВМ вклинической практике при обработке количественных диагяостических показателей заболевания.