Способ получения липосом

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХРЕСПУБЛИН 09) П 1) ВИДЕТЕЛЬСТВ ВТОРСКО с н ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ САНИЕ ИЗОБ(71) Институт биохимии АН Уз ССР(56) 1. Авторское свидетельство СССРМ 833242, кл . А 61 К 9/10, 1979.2. Торчилин В.П. и др. Сохранениенецифической связывающей способости антителами, ковалентно связанными с поверхностью липосом,.ДокладыАН СССР, т. 246, Р 3, 1979. 3(51) А 61 К 9/10, А 61 ЕНИЯ,щ. у(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ, включающий смешение фосфолипидов живой ткани с действующими веществами, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что.с целью повышения органотропности, предварительно смешивают ,фосфолипиды и холестерин, выделенные нз определенного количества живой ткани, и после добавления действующи веществ в полученную смесь вводят ганглнозиды, выделенные из того же количества одноименной ткани.10 35 Изобретение относится к медицинеа именно к способу получения органотропных липосом, которые могут бытьиспользованы в кардиологии, онкологии и других отраслях медицины.Известен способ получения липосомс использованием ткани печени (1) .Известен также способ получениялипосом, включающий смешение фосфолипидов живой ткани с действующимивеществамиОднако известные способы не обеспечивают получения липосом с достаточной органотропностью, так какприменяются липидные компоненты изразличных неидентичных к данной 15ткани фосфогликолипидов, а длясоздания заряда на поверхности липосом и придания реакционной способности применяют не встречающиеся вплазматической мембране химическиевещества, вследствие чего теряетсясродство липосом с природными мембранами тканей.Целью изобретения является повышение органотропности. 25Поставленная цель достигаетсятем, что в способе получения липосом, включающем смешение фосфолипидов живой ткани с действующими веществами, предварительно смешиваютфосфолипиды и холестерин, выделенныеиз определенного количества живойткани, и после добавления действующих веществ в полученную смесьвводят ганглиозиды, выделенные изтого же количества одноименнойткани,Способ осуществляют следующимобразом.Сначала выделяют из ткани меченные фосфогликолипиды, для этого 40Б-ацетил( 4,5,6,7,8,9,14-С)нейтраминовую кислоту в количестве 5 мкКи,удельной активностью 259 мКи/ммольвводят кролику весом 3 кг внутривенно и через 1 ч забивают декапитацией,45извлекают мозг, сердце, печень,легкие, почки, селезенку, склетныемышцы, поджелудочную железу и экстрагируют липиды в хлороформ-метаноле(2:1) из расчета 20 мл на.1 г ткани.Ганглиозидные фракции выделяют изобщих липйдов, диализуют противдистиллированной воды и хранят при0 С до использования. В дртой .серииоопытов вводят кролику 1-С -пальмитат в комплексе с бычьим сывороточным 55альбумином внутривенно, через часзабивают животное дикапитацией иизвлекают все органы, экстрагируютобщие липиды по Фольчу и очищаютФосфолипиды тонкослойной хроматогра" 60фией. Органную специфичность фосфогликолипидных липосом определяютпо ганглиоэидному составу тканей(см. табл,). Как видно иэ полученйых данных, введенные Фосфолипид -Сф - 65-ганглиозидные липосомы преимущественно связываются с теми органами, из липидов которых были изготовлены органоспецифические везикулы. В органах-мишенях введенные радиоактивности накапливались в количестве от трех до десяти раз большем, чем в органах не мишенях. Извлеченные таким способом липосомы являются естественными прототипами клеток тканей.Для того, чтобы доказать, что поверхностные ганглиозиды тканей определяют процесс узнавания клеток, были введены внутривенно кроликам 1-С -пальмитат -фосфолипидные(4липосомы печени без ганлиозидов и изучено их распределение по органам (см, табл. 2).Если сравнить результаты табл, 1 и 2, то видно, что за процессы клеточногс узнавания ответственны ганглиозиды пла.=.матических мембран тканей, фосфолипид-холестериновые фракции как в липосомах, так и в естественных мембранах играют структурную роль, т.е, способствуют поддержанию конфигурации мембран в наиболее оптимальном состоянии в условиях п чСго и целостного организма.На основе полученных экспериментальных закономерностей направления органоспецифических фосфолипид-ганглиозидных липосом была изучена избирательная транспортировка Н -оуабаина и 8-Н-аденозин,5-циклофосфата- -цАМФ, инкапсулированных в липосомы в мышцу сердца.Экстрагируют общие липиды из миокарда кролика, отделяют фосфолипиды, холестерин, ганглиозиды. Смесь фосфолипидов и холестерина, соответствующая двум граммам ткани, выпаривают от хлороформа досуха, затем добавляют 300 мкС оуабатна или цАМФ и 2 мл Кребс-Рингер- фосфатного буфера, рН. - 7,4, встряхивают до образования эмульсии, озвучивают при 22 кГц на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДНдри 4 С 45 с в электрическом полео2,5, В, диалиэуют в течение сутокпротив дистиллированной воды. После этого к липосомам добавляют ганглиозиды сердца, выделенные из двух граммов ткани, и тщательно перемешивают. Этот липосомальный препарат вводят кроликам и через 1 ч забивают животных дикапитацией, извлекают органы, экстрагируют препараты послегомогенизации в абсолютном этаноле, центрифугируют и в супернатанте считают радиоактивность в жидкостносцинтиляционном счетчике. Полученные результаты представлены в табл. 3, 4.Как видно иэ полученных результатов, введение оуабаина внутрь фосфоИсследова нные органы активность в (имп/мин/г ткани) АктивностьС 1 ф -ганглиоэида на липосоме Органоспецифические липосомыткани сердце печень мозг почки 22701156 826+87 290+ 21 375 ф 23 383066 СердцеПеченьМозг 270+18 4260+421 165+12 967,2 20413 606+59 3240+216 305+-26 22416 660+71 215+16 2206+159 200 ф 18 620+83 29423 300126 238+19 606159 132 ф 9,6 154 ф 13 243084 213356 206902 240968 225460 Почки ЛегкиеСелезенка Скелетныемышцы 841 ф 63 156+18 186+16 32021 216816 Поджелудочнаяжелеза 1268 ф 21 408+31 211+16 206+ 16 215989 липид-ганглиозидных липосом способствует в 10-12 раз большему накоплению препарата в мышце сердца, а в других изученных тканях существенных отличий от контроля не отмечается.Экзогенный ЦАМФ не проникает через плазматические мембраны тканей, но при окружении липидной ьеэикулой повышается сродство со структурой тканей. Липосомы, содержащие ганглиозиды, поглощаются быстрее и в большей степени, а в мышце сердца накапливаются Н -цАМФ в этих услоьиях в пять раз больше, чем без ганглиоэида, что свидетельствует о повышении органотропности и специфичности к миокарду. Предлагаемый способ по сравнениюс известным споособом обеспечиваетповышение органотропности лекарственных препаратов с помощью фосфолипид-ганглиоэидных липосом, способствует избирательной доставке кбольному месту беэ повреждения здоровых тканей.При применении этого способауменьшается доза введения различных 10 лекарствпри равноценном достижениилечебного эффекта. Благодаря введению лекарств в липосомах уменьшаетсятоксичность и появляется возможностьдля введения непроникающих препара тов внутрь клетки органа-мишени.Способ найдет применение при леченииболезней сердца, опухолей, наследственных нарушений.10) 2357 Продолжение табл 1 Исследованные органы(активность в имп/мин/г ткани) Органоспецифические липосомыткани легкие селезенка скелетные поджелудочнаяжелеза 465 ф 43 202+17 ЗООЙ 22 382+ 33 9816,3 700+59 416+ 43 208+16 510+53 700 ф бб 3315 т 283 310+24 Скелетныемьйзцы 285 21 4220+393 507141 22 ьф 13 Поджелудочнаяжелеза 22201193 121+7,2 492 46 2" 6+13 Примечание, Количество фосфолипидов, ганглиозидов, холестерина на липосоме соответствует 2 г ткани. Липосомы вводят в уьную вену кроликов, забивают декагитацией через 1 ч. Радиоактивность определяют в общей липидной фракции исследованных органов на жидкостно-сцинтиляционном,счетчике Марк Ш. Т а Распределение 1-С 4 -пальмитат-фосфолипидных липосом Ц в различных органах кролика (активность в имп/мин/гблица 2мозгаткани). Скелетныемышцы Мозг Печень Сердце Селезенка Поджелудочная железа Почки 18201120 11501110 1260+135 8500146014601145 2650+210 1250+ 115 Примечание. Количество фосфолипидов, холестерина на липоссмесоответствует 2 г ткани мозга. Вводят около 1,1 млн. имп/минвнутривенно кроликам, забой через 1 ч. Радиоактивностьопределяют в общей липидной фракции тканей. СердцеПеченьМозгПочкиЛегкиеСелезенка 330+23 157+12 23 бф 19 319 ф 26 3516+ 293 229+ 16 656156 162 ф 13 480+38 435+38 480+43 285+261022357 Таблица 3Распределение Н -оуабаина в органах кролика (активность в имп/мин/г3ткани). (Количество опытов 3) Скелетныемышцы Показатель Сердце Печень Поджелудочнаяаелеза Легкие Селезенка(активность в имп/минlг ткани), Количество опытов . 3) Сердце,Печень Скелетные мышцыФ Показатель Н -цАИФ без липосом 140117 108+9,3 160+20 Н- -цАМФ внутри ФосФоли 9пидных липосом 2216+175 4584 ф 350 96085 Н -цАИФ внутри фослипидю виаювтвма жтЗаказ 10614/8 ТИрай 713 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Х, Раушская иаб., д, 4/5е ав вН-оуабаннбез липосом 33501 18601 1140 54601 14801 1120+ 1050 т 29501 270 125 125 460 115 80 75 265