Способ окрашивания нервной ткани

) Авторизобретения ева итут физиологии;:. а Трудового Красно им. И, П. Па(54) СПОСОБ ОКРАШИВАНИЯ НЕ же раконтро м после чего пре гружают в фю данида амм они аммония 2,Изобретение относится к области медицины, а именно к гистологии,Известен способ окрашивания нервнойткани метиленовым синии на фосфатномбуфере путем погружения, нанесения иперфузии красящего раствора хлористого %метиленового синего в изучаемый органс последующей фиксацией краски 1.Недостатком этого способа являетсязатрудненная дифференцировка нервныхокончаний от ркружающнх тканей.Более совершенным является способ.окрашивания нервной ткани путем обработки ее строго изотоническим раствором метиленового синего в кислой средепри рН ниже 7,0, основанный на том,что нервная ткань в кислой среде дольше других тканей удерживает метиловыйсиний. Он заключается в том, что слоиьный растеор при концентрации красителя 0,01-0,035% доставляется в тканис током крови в избыточном количестведля окраски всех тканей, а затем красатель вымывается из нервных вканей и оставшийся быстро фиксируется. Изотоничность создается хлористым натрие постоянство рН,- 0,001 М раствором фосфатного буфера. Для лучшего выявления нервных структур в красящую смесь добавляют различные вещества - акцепторы водорода, а также глюкозу, пировинограднокислый натрий, соли магния. Спожный красящий раствор (количество подбирается опытным путем) под давле наем, близким.к артериальному, вводят в артерии наркотизированного животного в течение 8-20 мин. Затемобнажа ют исследуемый участок, быстро вырезают и переносят в дифференцирующузосмесь - тот створ, но без краси теля и под лем микроскопа в теч ние 8-15 мин следят за исчезновение окваски .нервных тканей до оптимальной степени яркости нервных элементов,парат немерленно пксатор иэ смеси роя и пккри 6 овокислого6861 4 5 10 нервных клеток и тканевых элементов15выявляются при определенных значенияхрН. По максимуму интенсивностии полноЗО 3 98К недостаткам способа отйосится лабильность окраски вследствие быстрогообесцвечивания, что затрудняет дифференцировку нервных волокон,Целью изобретения является улучшениедифференцировки нервных окончаний отокружающих тканей.Поставленная цель достигается тем,что при осуществлении способа окрашивания нервной ткани путем ее обработкиметиленовой синью последнюю берут вконцентрации 110М - 3 10М на0,1-0,25 М фосфатном буфере, при этомв процессе обработки рН раствора постепенно увеличивают от 4,5 до 7,0.Способ осуществляют следующим образом.Для окрашивания берут орган или кусочек органа только что забитого животного (мочевой пузырь лягушки, пищевод 20белой мыши, тонкую кишку черепахи).Лпплицируют красящий раствор в условияхкомнатной температуры (23-26 С).Оптимальным является раствор, содержащий хлористый метиленовый синий (выпускаемый Московским алкалоидным заводом, МВ) в концентрации 2,510М, растворенный 0,10,2 Мфосфатным буфером. Значения рН раствораувеличивают от порции к порции от 4,5до 7. В 265 опытах были выявлены всетипы нервных окончаний мочевого пузыря лягушки через 7 мин после начала ап.пликации раствора.Для сведения к минимуму недостатков фиксации химическими веществами(выявление волокон соединительной ткани, перераспределение окраски, вымывание окраски при обезвоживании и др.)фиксируют окраску путем высушиваниявоздухом 10-15 мин.Проверка опытным путем показала,что хорошие результаты получают приокрашивании раствором концентрации(1-3)10М. Оптимальной концентрацией является 2,5 х 10 М, Более высокие концентрации наряду с нервнойтканью интенсивно окрашивают и окружающие, а слишком высокие не позволяют выделить нервную ткань, закрашивая весь фон.Низкая молярность раствора (0,01 М)вызьвает варикозности, повреждения нервных волокон и прекращение их окраски,а также неравномерность окрашитанияразных участков органа и ткани. Точностькрасящего раствора повидимому являетсяодним из основных факторов удачной окраски и колеблется от 0,1 М до 0,25 М. Так О, 05-0,08 М вызывает неполную окраску нервных волокон и их окончаний мочевого пузыря лягушки, 0,2 М прекрасно выявляет нервные элементы, а 0,3-0 4 М дает постепенное ослабление окраски.Подбор рН раствора осуществляют исходя из того, что все типы нервных волокон и их окончаний (рецепторы, преганглионарные волокна с синапсами, вегетативные волокна) наиболее полно и градуально выявляются при рН от 4,5 до 7,0. Разные типы нервных окончаний 1 ты выявления тех или иных структур вусловиях возрастания рН нервные элементы исследованных объектов располагаются в следующем порядке: рецепторы централь ного происхождения; безмякотные волокна с окончаниями; аксоны местных нейронов; преганглионарные волокна. Так, наиболее полная интенсивная избирательная окраска рецепторов мочевого пузыря лягушки наблюдается при рН=4,5-5,0; безмякотные волокна выявляются при рН 5,8-6,0; синапсы при рН=6,4-7,0.У черепахи рецепторы центрального происхождения выявляются при рН=4,5-4,6; волокна и окончания вегетативногосплетения при. рН=5,8-6,6; аксоны местных нейронов при рН=6,2-6,4; дендридыпри рН 6,9. В пищеводе белой мыши рецепторы выявляются при более высокомзначении рН=5,9; моторйые бляшки прирН=6,2; синапсы при рН=6,2; волокна вегетативных сплетений при рН=6,0-6,2. Это, однако, не означает, что. каждыйтип нервных окончаний может быть;выявлен только при одном значении рН.Чмть окончаний выявляется и при других значениях. Окружающие ткани- фонтоже имеют рН - выявляемую характеристику, особенно, при рН выше 7,0. Поэтому метиленовый синий апплицируютпорциями, равномерно повышая рН от 4,5до 7,0,Предлагается оптимальное окрашивание при температуре 26 С. ПроверкаУвлияния различных температур показала,что низкие температуры (4-17 ОС) замедляют окрашивание, в то время как высокие (37-42"С) у холоднокровных (лягушки) ускоряют ее, но одновременно вызывают неравномерную окраску. участками. Для теплокровных (пищевод белоймыши" ,золотистого хомичка) также не5 9868рекомендуется температура окрашиваниявыше 35 С,После интенсивного выявления всехтипов нервных окончаний через 7-15 минот начала окрашивания (при этом продолж- Зжительность зависит от толщины препарата и плотности ткани) удаляют избытокраствора и сушат препарат до,.полноговысыхания оптимально при температуре25-ЗООС в течение 10-15 мин на воздухе. В результате такого высушиванияметиленовый синий химически не изменяется, сохраняя при этом все оттенкицвета, присущие окраски п чача . При.высоких температурах начинается разло фжение метиленового синего, Однако болеетолстые препараты можно сушить наустройстве для парафиновых срезов втермостате при 37-42 оС. Если препарат высушен не до конца, он со временем 20обесцвечивается. Поэтому полное высушивание препарата необходимо. Красительгигроскопичен и при этом способен кобесцвечиванию под действием света.4После высушивания следует обычное ироо- фветление ксилолом и заключение в даммарову смолу,Существенна свежесть материала,так как примерно через 1-1,5 ч переживания энергетический уровень обмена в Зйткани падает. П р и м е р 1. Мочевой пузырь лягушки, Мочевой пузырь разрезают в области лопастей, чтобы ригидное кольцо шейки д было сохранено,и осторожно расправляют на предметном стекле,-Прикрепив края разреза к стеклу (во избежание сокращений при окрашивании) апплицируют красящий раствор порциями, равномерй но повышая рН от 4,5 до 7,0, в течение 7 мин (дучше в затененных условиях) затем осторожно (промокатедьной бумагой) удаляют избыток краски и 1015 мин сушат на воздухе (25-30 С) М " После этого просветляют в ксилоле и заключают в даммарову смолу.П р и м е р 2. Тонкая кишка черепахи, Участок неразрезанной кишки, расправ.денный рамочкой, трубочкой, заполнением - или закреплением иглами окрашивают также как и мочевой пузырь лягушки, но удлиняют время аппликации красителя до 15. мин а сушку до 20-30 мин. Перед сушкой разРезают, отделяют от слизистой оболочки (так как она способствует обеоцвечиванию окраски и замедляет высушивание) и осторожно расправдяют на предметном стекле,61 6П р и м е р 3. Пищевод белой мыши,золотистого хомячка. Пищевод окрашивают 7 мин в расправленном состоянии(одетым на рамочку, трубочку, заполненный или закрепленный на концахво избежание сокращения), не разрезамтакже как: и мочевой пузырь лягушки.Затем разрезают,. отделяют от слизистойоболочки, расправляют на предметномтолике; сушат 20-30 мин; просветляют и заключают.Во всех случаях выявляются нервныеокончания, Раствор красителя: 10 мл0,2 М фосфатного буфера (а для тонкойкишки черепахи 0,1 М) порциями рНот 4,5 до 7,0 и 1 мг хлористого мьтиленового синего,Преимушества описываемого способа в обеспечении 100%-ного выхода качественных препаратов, простоте методики, сокращении времени окрашивания, стабильности результатов, исключении вредного воздействия света, так как отпадает необходимость ь микроскопировании. Распределение красителя в препарате соот- ветствует прижизненному,а также ликвидируется возможность выявления волокон соединительной ткани, вызванная фиксацией и затрудняющая дифференцировку нервных волокон. Обеспечиваются стабильные условия выявления нервных оконча-ний всех типов, получена возможность предотвращения обеспвчивания метиленового синего, Все вышеперечисленное дает возможность исследования окраски, полностью соответствующей прижизненной, что особенно важно для проведения качественной и количественной обработки материала. Кроме того, за счет исклю чения фиксации молибденовокисдым аммением и обезвоживания проводкой через абсолютный этиловый спирт значительно сокращается время процесса и отпадает необходимость в реахтивах. формула изобретения,. Способ окрашивания нервной ткани путем ее обработки метиленовой синью, о т л и ч а ю ш и й с я тем, что, с целью улучшения дифференцировки нерв ных окончаний от окружающих тканей, метиленовую синь берут в концентрации 1 х 10 э М - 3 ф 10М на 0,1-0,25 М фосфатном буфере, при этом в процессе обработки рН раствора постепенно увеличивают от 4,5 до 7,0.086861 7,Источники информации,принятые во внимание прн экспертизе 1. липли Р. Патогистологическая тезннка и практическая гистозимия, М.,фМир, 1969, с. 57-573.82, Шабадаш А, Л. Теория и практика прижизненной окраски нервной системы метиленовым синим.Горький, фМеднпинаф, 1939, с. 44 (прототип).Составитель Д. СоловьевРедактор. Г. Прусова Текред И.Гайду: Корректор А,П зяткоЗаказ 10428/28 Тираж 871 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРао делам изобретений и открытий113036, Москва, Ж 38, Раушскан наб., д. 4/5филиал ППП "Патент, ъ; Ужгород, ул. Проектная, 4