Способ определения гомосерина

О П И С А Н И Е953561ИЗОБРЕТЕН ИяК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскикСоциалистическииРеспублик(23) Приоритет до делам иэооретеиий и открытий(72) Авторы изобретения А, М, Босенко, Л. П. Шипяева, Н. Н, ЯкимА, В, Кузнецова, Е, И, Вапьгер и С, Ю. биэов.;,.;"1 Белорусский ордена Трудового Красного Знамени "1технологический институт им, С, М, Кирова(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЮМОСЕРИНА 1Изобретение относится к анапитической химии, а именно к способам опредепения гомосерина.Известен способ определения гомосе- рина методом тонкоспойной хроматогра 5 фии на сипуфоповых ппастинках, основанный на различной степени средства аминокиспот к неподвижному носитепю11.Недостатком способа является малая точность и дпитепьность анапиза (3-6 ч).10Наиболее бпизким по технической сушФности и достигаемым резупьтатам явпяется способ количественного опредепения аминокиспот, в том чиспе гомосерина газожидкостной хроматографией (ГЖХ) петучих К -трифторацетипметиповых эфиров аминокислот, получаемых реакцией ацетипирования аминокиспот триэтанопамином и метиптрифторацетатом в метаноле 1 21.Недостатком способа является мапая 20 точность и дпитепьность анапиэа (4-5 ч).Цепь изобретения - повышение точности определения и сокрашение времени проведения анализа. Поставленная цель достигается тем, что, согласно способу определения гомосе- рина, вкпючаюшему гаэожидкостную хроматографию летучих производных гомосе- рина, анализируемую пробу обрабатывают трифторуксусным ангидридом в ацетоне при 15-30 С и в случае определения синотетического гомосерина допопнитепьно обрабатывают диазометаном с поспедующей газожидкостной хроматографией образую- шихся летучих производных. В качестве летучих производных используют Н, 0-трифторацетиппроизводное гомосерина (при опредепении гомосерина в биологических объектах) ипи метиловый эфир Й,О-трифторацетипгомосерина (при определении гомосерина в синтетических продуктах).При определении гомосерина в биологических объектах М,О-трифторацетиппроизводные гомосерина попучают реакцией ацетипирования гомосерпна трифторуксусным ангидридом прн концентрации 50дорН 7,оИК 4,М 1 ао1 Ю где С 3 95356100 мас.% в среде ацетона и температуре 15-30 С в течение 3-5 мин.При определении гомосерина в синтетическом продукте М,О-трифторацетилпроиэводное гомосерина получают реакцией ацетилирования трифторуксусным ангидридомпри концентрации 10-25 мас.% в средеацетона при 1 5-30 С в ечение 3-5 мин,оМетиповый эфир Я,О-трифторацетилгомосерина получают метилированием диазоме Фтаном в эфире в течение 0,5-2 мин,В качестве внутреннего стандарта применяют высшие спирты и эфиры моно-,идикарбоновых органических кислот,Гаэохроматографический анализ проводят на любом типе хроматографа с пламенно-ионизационным детектором.Хроматографическая колонка из нержавеющей стали (50-300 см длиной и внутренним диаметром 0,2-0,4 см) заполне- г 0на 0,5-6,0%-ной полиэфирной жидкой фазой на инертном носителе, например полиэтиленгликольадипинат на хроматонеИ -ЛЖ/- НМЗ Б Газ-носитель - любойинертный газ, например азот, 25При определении гомосерина в продукте, полученном химическим методом, используют режим с линейным программированием при изменении температуры от50 до 200 С (1-10 С/мин) или изотер-з 0оЪмический при 120 С,При определении гомосерина в биологических продуктах используют режим слинейным программированием при изменении температуры от 20 до 200 С (1-о10 С/мин) или изотермический при 160 С.Относительная ошибка определения 2-4%.При определении гомосерина в биологических и синтетических продуктах, сойержащих значительные количества примесей,40в частности нейтральные кислоты и неорганические киспочы, необходимо очищать .гомосерин с помощью катионообменнойсмолы, например КУ-8 в Н -форме,элюируя гомосерин 4 н. раствором аммиака. Смола переводится в Н+-форму одним из обычных способов.П р и м е р 1, Определение гомосерина в модельных растворах, содержащиххимически чистый гомосерин, в синтети 50ческом гомосерине, попученном химическим, методом.Копичественный анализ определениягомосерина проводят по высоте пиков нахроматограмме методом калибровки поописанной ниже методике, Для учета воэ 55можных механических потерь гомосеринапри очистке проб с помощью ионообменных смол калибровочный график строятс использованием раствора химическичистой аминокислоты, которая выделяется также ионообменными смолами в идентичных условиях.5,0000 г синтетического гомосерина взвешивают на аналитических весах с точностью до четвертого знака, растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 25 мл,3 г подготовленного катионита влажностью 50% заливают 1.мл пробы, добавляют 5 мл дистиллйрованной воды для лучшего перемешивания и проводят сорбцию аминокислоты в течение 15 мин приинтенсивном перемешивании содержимогос помощью магнитной мешалки. Смолу,содержащую аминокислоты, промывают во,взвешенном слое дистиллированной водой Катионит отделяют от жидкости на фильтре Шотта,.при этом хорошо отсасывают межчастичную воду. Содержание воды в смоле 50% что составляет 1,5 мл. Смолу количественно переносят в стакан, добавляют 2,5 мл 4 н. ЙНОН и проводят элюирование гомосерина в течение 15 мин. После оседания смолы надосадочный раствор объемом 1 мл вносят в колбу с притертой йробкой для упарива ния, К остатку добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора трифторуксусного ангидрида в ацетоне. Реакцию ацетилирования проводят в течение 5 мин при 1 УС. Остаток реагентов удаляют холодным воздухом в течение 5 мин.К остатку добавляют 1 мл диазометана, встряхивают в течение 0,5 мин, удаляют диазометан холодным .воздухом, добавляют 1 мл 0,2%-ного раствора додеканового спирта в ацетоне (внутренний стандарт). Пробу вводят в испаритепь хроматографа, Общее время анализа 45- 60 мин, Время газохроматографического анализа 15-20 мин,Расчет процентного содержания гомосерина в анализируемом образе ведут по формуле процентное содержанйе гомосе-рина в анализируемом образце;содержание гомосерина по калибровочному графику, мг/мл;навеска синтетического гомосерина, мг; 4 - содержание аммиакаи воды в смоле, мл; 25 - общийобъем после разведения; 100"проценты,953561 Пример расчета; С 3,97 425 Таблица 1 Ореля реТел 1 ператуакции вие ра ревниннтипироввваетипиро 4ння, мнн, нанни, оС1 ОшибкаОбщее опредене-время акаиия,юаа, мин Содержание гомоКоннеит рациятфЛ в аиетоне, ланс.Ъ резцы растворов омосерннв,. отн,Ъ Модельный водный раствор,содержаший 1,5 Ъ химически чистого гомосерпна 1,4 45 2 45 Э,Э 45 1,5 1,4 175 2,5 1,45 5 з 15 4 22 5 5 эо 2 жвший гомтый хнмичесРаствор, сод серии, попуче ким методом 7,9 В 7,97 9,45 3. Образец (по и. 2) с добав кой 1,5 Ъ химического го 17,5 мосернна1,9 9,Э 1 22,5 47 2,4 9 зо 10 240-30 пестный м е ч а н н е. Ошибка определения предлагаемого метода не превышает т Э,ЭЪ. аб пи яа 0 15 1, Модельный водный раствор содержащий 5 г/л зимичес ки чистогр гомосерина 1,8,92 ,05 2 0 0 5 0 5 2,8 5 5 3, Образец (ио п, 2 кой 5 г химическ гомосерина на 1 8,85 8,70 с добывчистогообразца10,9 ,0 2 0 78 Э 5000100; С = 7,95%,Примеры 2, 3 и резупьтаты определения гомосерина в модепьных растворах,синтетическом гомосерине, полученномхимическим методом, приведены в табл,1,П р и м е р 4. Опредепение гомосерина в модельных растворах, содержащиххимически чистый гомосерин в биопогичес-ких объектах.Методика выдепения гомосерина избиологических объектов аналогична описанной в примере 1.1 мп аммиачного раствора гомосери 15на вносят в колбочку с притертой пробкой дпя упаривания. К сухому остатку до, бавляют 04 мл 50% ного раствора трифторуксусного ангидрида в ацетоне, Реак 2 л Гомосериыовая культураа 50иая жидкость, полученная с помощью микроорганизмов 100 цию ацетипирования проводят в течение 3 мин при 15 С, Остаток реагентовудапяют хоподным воздухом в течение 0,5-.1 мин, К остатку добавпяют 1 мп 0,1%- ного раствора дибутипфтапата в ацетоне (внутренний стандарт), Расчет ведут аналогично примеру 1.1 Примеры и результаты опредепения го мосерина в модельных растворах приведены в табп. 2,Использование предпагаемого способа определения гомосерина методом газо- жидкостной хроматографии по предложенной методике повышает в 1,5-2 раза точность определения и сокращает время проведения анализа до 45 мин, т.е. в 6- 8 раз.953561 8 Йрсдолмеиио табл. 2 Оцшбка определ ни я,отн,%Общеевремяанализа,Темпе ратура реакциивцетилнрования,е С Концентра- Время ция ТФА в реакции ацетоне, вцетнлимас,% роввния,мин Содержание гомосе- рина, гlп Образцы растворов гомосерннв,2 5 70-3 Ошибка определения не превышает,1% относительных римеча ф ормул з абатывают диазометай газожидкостной хрозуюшихся летучих пр н дополнительно обном с последуюшматографией обризводных. Спо чаюшиле тучилич с выш бу обр ридом опреде Составитель В, Гладков Редактор А, Козориз ТехредМ,Рейвес Корректор И. МускаПодписноеого комитета СССРй и открытийРаушская набд, 4/5 73 Тираж 887 ВНИИПИ Государственнпо делам изобретени 13035, Москва, ЖЗаказ 62 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, уп. Проектная, 4 75100 (по п, 4) с добвв химически чистого на на 1 л образца100 соб определения гомосерина, вклюгазожидкостную хроматографию производных гомосерина, о т -ю щ и й с я тем, что, с целью ния точности способа и сокращемени анализа, анализируемую пробатывают трифторуксусным ангидв ацетоне при 15-30 С и в случае ения синтетического гомосерина ники информации,внимание при экспертизеЭ, Хроматография в тонкихир, 1965, с. 393,пд ГСторрс Ж, Газоваяв биохимии, М"Мир",4-536 (прототип),принятые в 1. Шталь слоях. М., "М 2, Берчфи хроматографи 1964, с, 53