Способ определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДВТИЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик и 934322Дата опубликования описания 07,06.82(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРОФЛУОРЕСЦЕИН В АИИНОФЛУОРЕСЦЕИНЕ Способы цеинд в дм туре не оп определ нофлуор саны. бретени еделени луоресц Флуореслитерания ни сцеине Цель из пособа оп а в амино разнитроне. аботкалуоресцеигае флуоресцеием измереенции ана- ,0005 Н ри 486 и го содерформулеоК) ЬС 250 10 20 ь люмой сценции анали обы при 434 н Изобретение относится к аналитической химии, а именно к люминесцентному анализу органических веществ,и предназначено для определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине..Аминофлуоресцеин - это исходный 5продукт при получении изотиоцианатафлуоресцеина (ФИТО), являющегося одним из основных красителей, используемых для метки белка, Качествоаминофлуоресцеина характеризуют следу 10ющие показатели: хроматографическаяоднородность и содержание аминофлуо ресцеина (не менее 973), определяемоедиазотированием 11 1.Известен способ определения амино- тзфлуоресцеина в изотиоцианате флуоресцеина, заключающийс в том, что анализируемый образец растворяют.в ацетоне и измеряют люминесценцию растворапри 403 нм 2 ,. Исходным продуктом при полученииаминофлуоресцеина является нитрофлуоресцеин, примесь которого в готоом продукте (аминофлуоресцеине) не"елательна. Поставленная цель достспособом определения нитрна в аминофлуоресцеине пуния интенсивности люминеслизируемой пробы в средераствора соляной кислоты434 нм и расчета процентножания нитрофлуоресцеина по е 3 - средняя интенсив- интенсивность люминесцен-ции анализируемой пробыпри 486 нм;3 - интенсивность люминесценции анализируемой пробы с здобавкой нитрофлуоресцеинапри 486 нм;К - коэффициент пересчета, равный 42;ЬС - добавка.нитрофлуоресцеина,г; Оц - навеска образца, г.Способ осуществляют следующимобразом.Наееску испытуемого образца аминофлуоресцеина растворяют в абсолюти-. 1 з рованном этиловом спирте (присутствиеводы уменьшает чувствительность определения). Одновременно готовят раствор нитрофлуоресцеина в спирте, Затем.отбирают аликеотные части раствора аминофлуоресцеина, вводят определенные количества раствора нитроФлуоресцеина (добавки), подкисляют и через 30 мин измеряют интенсивности люминесценции растворов при 25 А =486 и 434 нм при возбужденииЛсветом с А =450 и 343 нм соответственно. Количественное определение нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине выполняют методом добавок, 30При использовании в качестве растворителя спирта, диметилсульфоксида, ацетона, уксусной кислоты растворы нитро-и аминофлуоресцеина имеют одинаковую желто-зеленую и соизмеримую по интенсивности люминесценцию, а у аминофлуоресцеина наблюдается еще и значительная люминесценция е синей области. Таким образом, определение люминесцирующей примеси нитрофлуоресцеина на фоне люминесценции аминофлуоресцеина практически невозможно, Необходимо либо разделение люминесценции этих соединений либо учет вклада каждого соединения в общую люминесценцию.1Установлено, цто при подкислении спиртовых растворов амино-и нитрофлуоресцеина в области концентраций кислоты 10 -1 10 М наблюдается уве- о личение интенсивности люминесценции нитрофлуоресцеина в 25 раз, при этом у аминофлуоресцеина интенсивная синяя полоса с увеличением концентра ции кислоты в растворе уменьшается. Этот эффект положен в основу предлагаемого способа определения нитрофлуоресцеина. В качестве рабочей концент 2 4рации выбрана 5 10 4 И кислоты, прикоторой наблюдается максимальноеувеличение интенсивности люминесценции нитрофлуоресцеина, в то времякак люминесценция аминофлуоресцеинаизменяется незначительно, т.е, имеютдело практически с нелюминесцирующейФормой аминофлуоресцеина,Поскольку полосы люминесценциинитро-и аминофлуоресцеина совпадают(А=486 нм), поэтому при их совместном присутствии ийтенсивность люминесценции в этой области определяетих суммарное содержание. Так какаминофлуоресцеин обладает еще и синей полосой то колицественную характеристику его можно. проводить какпо синей (434 нм), так и по зеленой(486 нм)"полосе люминесценции. Введя коэффициент пересчета К, учитывающий соотношение интенсивностейэтих полос, можно, учесть вклад аминофлуоресцеина в суммарную люминесценцию обоих соединений (нитро-и аминоФлуоресцеина), измеренную при 486 нм.Коэффициент К подсчитывают по тремобразцам аминофлуоресцеина, практически не содержащих нитрофлуоресцеин,Так как интенсивность люминесценцииаминофлуоресцеина при 486 нм значительно больше, цем при 434 нм, то измерение. интенсивностей люминесценциипри этих длинах волн выполняется приразличных напряжениях прибора. Коэффициент 42 (отношение полос люминесценции 0486/ Э 434) автоматически включае .в себя и поправку на усиление прибора при переходе от напряжения 100 к 1000 В.В табл, 1 приведен подсчет К для образца, практически не содержащего нитрофлуоресцеин,П р и м е р. 0,017 г аминофлуоресФцеина в 250 мл абсолютированного этилового спирта, 0,01 г нитрофлуоресцеина растворяют в 100 мл такого же спирта, 1 мл полученного раствора помещают в пробирку, прибавляют 9 мл спирта, перемешивают. Полученный раствор содержит 10 мкг/мл нитрофлуоресцеина (рабочий раствор).В три прооирки емкостью 10 мл помещают по 1 мл раствора аминофлуоресцеина, во 2-ю и 3-ю - соответствеНно 0,4 и 0,8 мл рабочего раствора нитроФлуоресцеина, во все пробирки добавляют по 0,5 мл 0,002 М НС 1 в спирте,5 934322 6спиртом доводят до 5 мл и перемеши- цеина вычисляют по вышеприведеннойвают. :ерез 30 мин измеряют интенсив- формуле.ности люминесценции всех растворовпри 3.=486 нм (возбуждение ХВ=450 нм)и при = 434 нм (возбуждениеЛу, 343 йм). Содержание нитрофлуорес 22 434 92422 48 б Таблица 2 Образец ЗоК х,3 д,С,г 9,г( 3 "док) ь с 250 100 Формула изобретения 55 где Зо- средняя интенсивность люми. несценции анализируемой пробы при 434 нм; Способ определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, измеряют Время проведения анализа 40- 45 мин. Предел обнаружения 0,08 мкг/мл.Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять примеси нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине, что позволяет улучшить качество получаемого из него красителя. Результаты определений нитрофлуо ресцеина в трех образцах аминофлуоресцеина приведены в табл. 2.Таблица 1 интенсивность люминесценции анализируемой пробы в среде 0,0005 И раствора соляной кислоты при 486 и 434 нми рассчитывают процентное содержаниенитрофлуоресцеина по формулеЗаказ 3916/37 Тираж 887 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 интенсивность люминесценции анализируемой пробы при486 нм;интенсивность люминесценциианализируемой пробы с добавкой нитрофлуоресцеина при486 нм;добавка нитрофлуоресцеина, г; 8ц - навеска образца, г;К = 42,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. ТУ 6-09-144-742. Авторское свидетельство СССРпо заявке Ю 2723864/04,кл. 0 01 М 21/64, 1979.