Способ выявления распределения гуанилатциклазы в тканях

Союз Советскик Социалистических РеспубликОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВ ТИЛЬСТВУ(22) Заявлено 080230 (21) 2879203/28-13 (51) М 1 Л С 12 Й 1/42 с присоединеннвм заявки М -Государственный комитет СССР ио делам изобретениИ н открытий. Ф,) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГУАНИЛАТЦИКЗАЗЫВ ТКАНЯХ ю в 1- 5 М как люкозой ре рН ф латном 1 сут.отбраково инкуриа- режи 25 Изобретение относится к медицине,а именно к цитохимии, и может бытьиспользовано для электронно-микроскопического выявления гуанилатциклаэы.Известен способ выявления распределения гуанилатциклазы в тканях 11 .Однако такой способ позволяетполучить только количественный анализ определения активности ферментаи не обеспечивает воэможности локализации и органной специфичностигуанилатциклазы в клетке в норме ипатологии.Цель изобретения - повышение точности способа и упрощение его.укаэанная цель достигается тем,что при осуществлении способа выявления распределения гуанилатциклаэыв тканях последние инкубируют притемпературе 30-34 С в течение 5055 мин в среде, содержащей 80 мМтрисмадеатного буфера,13-14 мМ глюкозы, 1-2 мМ теофиллина,0,1-0,5 мМГТФ и 4 мМ Ва (КОЗ), затем йх обезвоживают, заливают в эпоксиднуюсмолу и проводят электронную микро-скопию,Способ осуществляют следующим образом. Проводят фиксаци ном глютаральдегиде на 0,0 одилатномбуфере с 4,5-ной г 1 ч прикомнатной температу , иксато ра - 7,4,Промывают в 0,05 М какодибуфере с глюкозой в течениеНа следующий день производятку материала для оптимальногбирования материала.Инкубацию осуществляют при + 30+ 34 С в течение 50-55 мин (оптимальная продолжительность инкубации).Для оптимизации выявления фермен та были испробованы 6 вариантов инкубационной смеси.В табл, 1 представлены мателы оптимизации температурногома и время инкубации.20 С помощью табл.2 установлено, чтодля определения активности гуанилатциклазы в различных органах необходим определенный вариант.Инкубационная смесь включает,мМ:трисмалеатный буфер 80глюкоза 13теофиллин 1-2ИпС 0,1-0,5ГУб 0,1-0,5 30 Ва 1 ноЗ )14876715 После инкубации производят быструю промывку материала в 0,08 М трисмалеатном буфере.Дриофиксацию в 1 ОВ 04 на 0,05 М какодиалатном буфере с глюкозой (рН=7,4) проводят в течение 1 0 оУ.1,5 ч при 4 С, промывку - в 0,05 М какодилатном буфере с глюкозой (рН=7,4) . Дегидратацйю осуществляют в ацетонах возрастающей крепости (30 ф, 50 ф, 70 ф, 96 О, 100 ф) и заливают в смесь опона с аралдитом. Предлагаемый способ .при исследовании кусочков ткани иэ некоторых органов млекопитающих (тонкого кишечника, сердца, легких, печени, поджелудочной железы ) позволяет определитьстрогую специфичность локализациигуанилатциклазы, а также установитьее видовую и органную специфичность,выявление гуанилатциклазы поможетвскрыть механизмы активации фермента как в физиологических, так и внекоторых патологических состояниях,что является чрезвычайно важным моментом в расшифровке проблем молеку"лярной биологии,Таблица 1 Время инкубации, мин 30 40 Температура 0 Сю т ее ермент не фермент не фермент н ыявляется выявляется выявляетс слабаяреакция выявленияфермента Слабая реация выявления фермента Фермевыя Слабаяреакциявыявленияфермента нт не яется Фермент не выявляется Оптимальнареакциявыявленияфермента Слабаяреакциявыявленияфермента Слабаяреакциявыявленияфермента еакцияеравноерная лабая еакция ыявления ермента Гипер- реакция СлабаяреакциявыявлениФермента Гипер- реакци Слабаяреакциявыявленияфермента Слабаяреакциявыявленияфермента Реакция неравно мерная Гипер- реакци ипер- еакция 7 Слабаяреакциявыявленфермент еакция еравно- ерная ипер- еакция Реакциянеравновыявленияфермента Гипер- реакци Реакциянеравно- мерная Слабаяреакция выявлены фермента Кроме предлагаемой инкубационной смеси, применяется инкубационная смесь, в состав которой помимо укаэанных компонентов входит еще Май -азид натрия, который является специфическим активатором гуанилатциклазы. После удаления азида натрия иэ инкубационной смеси активность гуанилатциклазы возвращается к норме.Для оптимизации выявления фермента с помощью активатора гуаннлатциклазы азида натрия были испробованы также 6 вариантов инкубационной смеси, которые приведены в табл.3.Например, для оптимального выделения фермента в клетках тонкого кишечника, печени и поджелудочной 5 железы млекопитающих необходим 1 Ч вариант инкубационной смеси, для оптимального выявления фермента в клетках легких и сердца - 1 Т вариант.Теофиллин .вводят в инкубационную Щ смесь для ингибации фосфодиэстараэы (ФДЭ), что способствует увеличению уровня цГМФ в клетке, необходимого для активации катализа ферментативной реакции ГТФ или гуанилилмидодифосфат - специфический субстрат выявления гуанилатциклаэы. Ва(ЙОЭ)1- маркер выявления фермента. Слабая реак- Слабая ция выявле- реакция ния фермен- выявлени та фермента876715 Т а б л и ц а 2 Вариантсмеси Содержание компонентов, мМ Ва(й 09 ) Реакциявыявленияфермента 80 13 0,5 0,1 80 13 0,5 0,3 0,5 0,5 80 13 Слабая реакция во всехорганах 0,1 0,1 80 13 0,1 0,3 80 13 Слабая реакция во всехорганах фермент не выявляется 13 0,1 0,5 80 Содержание компонентов, мМ йпС 1 ГТФ.0,5 Нет 0,5 80 11 80 0,5 0,3 Трисма- Глюкозалеатныйбуфер Теофиллин МпС 1 ГТФ фермент не выявляется Оптимальнаяреакция дляклеток сердца и легких Оптимальная реакция для клеток тонкого каучука, поджелудочнон железы, печени Таблица 3 Оптимальная реак ция дляклетойсердца и легких,выявленияфермента Вариантсмеси Трис- Глюко- Теофил- Мп 01 ГТФ РЬ(МО) МаМмалеат- эа линный бу- фер 111 80 Слабаяреакцияво всех 0,5 0,5 органах 80 0,1 0,1 0,3 0,3 Слабаяреакцияво всехорганах 80 0,5 0,5 и 4 мМ Ва(МО Э) затем из обезвоживают, заливают в Эпоксидную смолу и проводят электронную микроскопию.Источники информациипринятые во внимание при экспертизе1, 5 сйц 1 сг С., На гдщап 1.0. ей а 11 А пех епгува 1 1 с азьау Гог 9 иапов 1 пе 3,5"сус 11 с еопорЬоврйасе апд 1 сь аР" Р 11 сай 1 оп йо СЬе дцсСив геГегепь оТ йЬе гай, Ргос. Май. Асад, 5 с 1, 05 А, 1973, т. 70, Р 6, с. 1721-1725. Формула изобретения Составитель В.МалютинаТехред И,Асталош, Корректор, Л Бокшан Редактор Н.Безродная Заказ 9515/32Тираж 531 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/4/5 Филиал ППП "Патент" г. Ужгород, ул. Проектная,фСпособ выявления распределения гуанилатциклазы в тканях, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа и упрощения его, ткани инкубируют при темпе ратуре 30-34 фС в течение 50-55 мин в среде, содержащей 80 мМ трисмалеатного буфера, 13-14 мМ клюкозы, 1-2 мМ теофиллина, 0,1-0,5 мМ ГТФ Оптимальная реакция дляклетокпищеварительнойсистемы