Способ хроматографического разделения смеси пурин-и пиримидинсодержащих соединений

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советскни Соцнаанстнческнк Реснубпнк(61) Дополнительное к (22) Заявлено 0509,79 с присоединением зая (23) ПриоритетОпубликовано 2 вт. свыд-ву 21)2822278/2351) М. 1 й 31/О Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытий(53) УДК 543, .42(088,8 ата опубликования описания 2308изобретены сесоюэный научно-исследовательский нститут антибиотиков и Ферментов м 1) Заяви 4) СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСК ПУРИН- И ПИРИМИДИНСОДЕ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИИХ СОЕДИНЕНИЙ меси пуринсоединенийрастворит5 М растводержащую,ор ия щи ст раздел инсодер е, в ка уют 0,0 ли смев рас еля, р триобе: о 15-30спирт До 100ержащую, об.:раствор25-3510-25 му 30 гра 15-25 До 100 исследо ые и пир озиды, а фосфат сфат фосфа сфат ат ве пласти или ка геля 2-3 капли имо АТФ в нати аИзобретение относится к химии и технологии получения пурин- и пиримидинсодержащих соединений, конкретно к методам их анализа и препаратив 5 ного выделения.Известен способ хроматографического разделения смесей пурин- и пиримидинсодержащих соединений в смеси растворителеи третамиловый спирт, равьиная кислота и вода11 .Недостаток этого способа - неполнота разделения пурин- и пиримидинсодержащих соединений в присутствии различных примесей.Известен также способ хромато фического разделения смеси пурин- и пиримидинсодержащих соединений в смеси растворителей н-бутанол, ацетон, ледяная уксусная кислота, 5 раствор аммиака, вода, взятых в соотношении 93:2:2:4 21.Недостатком известного способа являетсй его невысокая эффективность в присутствии примесей органической и неорганической природы.Цель изобретения состоит в повышении эффективности разделения смеСИУказанная цель достигается тем, что согласно способу хроматографи- ЗО ческ ого ен спирнмид жа хворител че веиспольз 05-0,0лона Б и сь, со25-ный водный растваммиака0,02-0,05 М раств ртрилона БИзопропиловыйили смесь, сод25-ный водныйаммиакаАцетон0,02-0,05 М раствортрилона БИэопропиловый спиртВ качестве объектовния были взяты пурнновновые основания, нукленуклеотиды:АТФ-аденоэин-триАДФ-аденозин-дифо(АМФ-аденоэкн-моноУМФ-уридин-монофоУДФ-уридин-дифосфП р и м е р 1. На дс закрепленным слоем с,8 О 005 5 тивном растворе содержатся в качестве балласта соли, пигменты, органичес- кие соединения. Элкирующую систему приготавливают следующим образом; берут 20 ацетона, 30 25-ного водного раствора аммиака, 30 изопропилового спирта и 20 0,05 М раствора трилона Б в воде, компоненты тщательно перемешивают взбалтыванием. Для сравнения готовят контрольную систему без трилона Б, заменяя трилон Б дистиллированной водой. Пластинки опускают в камеры, насыщенные парами элюата, Через 40 мин пластинки вынимают, подсушивают и проявляют в ультрафиолетовом свете.При хроматографировании нативного 5 раствора в контрольной системе получают отрицательные результаты - все компоненты идут сплошной полосой.В системе, содержащей трилон 20 Б (динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), получают четкое деление на несколько, пятен. По положению свидетелей основные пятна идентифицированы как АТФ (йр = 0,35), АДФ(ар=0,46) у АМФ(Н 0,55) и аденин (К =.0,73) .П р и м е р 2, На две пластинки с закрепленным слоем силикагеля - "Силуфал" наносят 2-3 капли нативного раствора УМФ. Приготавливают следующую элюируюшую систему: ацетон 10, 25-ный водный раствор аммиака 34, изопропиловый. спирт 3 б, 0,02 М раствор трилона Б в воде 20, компоненты тщательно пере- З 5 мешивают взбалтыванием, Для сравнения готовят контрольную систему без трилона Б, заменяя его дистиллированной водой, Хроматографирование осуществляют по примеру 1. 40При хроматографировании нативногораствора в контрольнойсистеме деление компонентов смеси отсутствует. В системе, содержащей трилон Б, получают четкое деление на несколько пятен. По положению свидетелей основные пятна идентифицированы какУМФ (Н = 0,45) и УДФ (В= Ор 32)юП р и м е р 3, На две полосы хроматографической бумаги наносят 3-5 капель нативного раствора АТФ, Элюирую" щую систему готовят следующим обраОпыт 2 дан в тексте (пример зом: берут 10 25-ного раствора аммиака, 70 иэопропилового спирта и 20 0,05 М раствора трилона Б в воде, тщательно перемешивают вэбалтыванием. Контрольная система включает 10 25-ного раствора аммиака, 70 изопропилового . спирта и 20 водыеРазделение проводят методом нисходящей хроматографии. Время разделения 11-12 ч. После просушки хроматограммы проявляют в ультраФиолетовом свете. При хроматографировании нативногораствора в контрольной системе получают отрицательные результаты,В системе, содержащей трилон Бполучают четкое деление на несколько пятен. По положению свидетелейосновные пятна идентифицированы каксоответствующие нуклеотиды (АТФ, АМФ,дду), в =о, 07, й =О, 10, й=О, 15,В =У,57.П р и м е р 4. На две полосы бумаги для хроматографии наносятся3-5 капель гидролизата мицелия инозина, Элюирующей системой является0,01 М раствор трилона Б, Для контроля готовят систему согласно известному способу, включающую трикомпонента: 12 частей бутанола, 3 части уксусной кислоты и 5 частей воды.Разделение проводят методом нисходящей хроматографии. Время хроматографирования в контрольной системе составляет 16 ч, в растворе трилона Б3 ч (при равных расстояниях линиифронта от линии старта в обеих хроматограммах),При хроматографировании нативногораствора в контрольной системе получают отрицательные рузультаты - всекомпоненты идут сплошной полосой,окрашенной в желтый цвет, обусловленный наличием пигмента.В растворе трилона Б получаютчеткое деление раствора гидролизата на 4 пятна, идентифицированныекак аденин, гуанин, тимин и цитозин.цчоьдн ф 8 фВарианты элюирующих систем и результаты хроматографического разделения приведены в табл, 1-3.Элюирующая система Анализируем системезопро- Ацетонилоыйпирт Аммиак ТрилонБ 25 НативныйрастворАТФ (АссАДФ, АМФ,аденин) 25 1 25 2 30 30 201 20 15 . -с 35 3 40 10 25 НативныйрастворУМФ (УМФ,УДФ) 4 25 25 25 0,43 0,35 10 36 0,45 0,32 2011 34 0,44 0,38 15п 10 35 б 40. Опыт 2 дан в тексте (пример 1). Опыт 5 дан, в тексте (пример 2). Таблица 3 т ующая систе нализ ируемраствор н Б ак Изопропиловспирт 3 ативныйор АТФАДФ, АМФнин растАТФ,аде 20 07 0,10 0 с 57 2 О,0,08 0,1 3 7 2 дан в тексте (пример 3). ле, о т л и ч а в щ и,й с я тем, что, с целью повышения эффективности разделения смеси, в качестве оаство рителя используют 0,005-0,05,М раст изобретенияматографического разпурин- и пиримидиндинений в растворит ОпытформулаСпособ хро еления смеси одержащих со 8 компонентов системы АТФ АДФ АМФ Аде- УМФ УДФнин 0 с 32 О с 42 0 с 50 О с 70 0,35 0,46 0,55 0,73 0,40 0,48 0,56 0,75 й компонентов системы ТФ АДФ АМФ Адвнин с 04 0,06 О, 10 О,857856 10-25 Составитель С,ХованскаяТехред,С. Мигунова Корректср Н,Швыдкая Редактор О.малец Заказ 7233/73 Тираж 907 Подписное ВНИИПи государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППГ Патент" г. Ужгород, ул. Проектная, 4 вор трилона Б нли смесь, содержащуюоб,%25-ный водный раствор аммиака 5-100,02-0,05 М раствортрилона Б 15-30Изопропиловый спирт До 100или смесь, содержащую, об.125%-ный водный раствораммиака 25-35 Ацетон0,02-0,05 М растворУрнлона Б 15-25Изопропиловый спирт До 100Источники информациипРинятые во внимание при экспертизе1. Хроматография в тонких слоях.Под ред. Э.Шталь, М., "Мир", 19 б 5,с. 443.2, Там же с. 445 (прототип).