Способ определения активностиглюкозо-1-фосфатазы k. ф. 3. 1. 3. 10 b сперме

О П И С А Н И Е (11)819 УОИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Ооеетских Социалистических РеспубликК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 61) Дополнительное к авт, свид-ву 22) Заявлено 19.06.78 2647765/30 1) М КлзС 120 1/42 аявкис присоедине сударствеииын комите СССР е делам иэебретеии и открытий(45) Дата опубликова описания 07,04.81(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИЛЮКОЗО-фОСФАТАЗЫ (К. ф. 3,1.3.10) В СПЕР Целью изобретения явлточности определения акт1-фосфатазы.Для достижения указанвведением пробы спермысмесь вносят фтористый ннатрия при следующем спонентов, мкг/мл:фтористый натрийАрсенат натрия ется повышение вности глюкозоной це и передционнуюарсенаии ком атрийоотнош 39,9 34,6 279,9 69,3 10(71) Заявитель Полтавский научно-исс Способ относится к методам исследова.ния, а именно определению активностиферментов в биологических тканях.В доступной нам литературе мы не встречали описания методики определения актовности глюкозо-фосфатазы в биологических тканях,Для определения активности глюкозофосфатазы в гомогенате печени и в сыворотке крови существует метод В. С. Асатиани, который основывается на количествеотщепившегося фосфата от глюкозо-фосфата 1.К инкубационной среде, состоящей из0,5 мл веронал-ацетатного буфера рН 6,5,вносят 0,2 мл сыворотки кровки и 0,3 мл0,01 М раствора глюкозо-фосфата, смесьинкубируют при 37 С в течение часа, Конечный объем реакционной смеси 1 мл,После инкубации и осаждения белков втрихлоруксусном фильтрате определяют неорганический фосфат по методу Фиске-Суббороу.Определение активности глюкозо-фосфатазы этим методом недостаточно точный,так как здесь имеет место наслоение действия неспецифических фосфатаз и он неподходит для определения активности глюкозо-фосфатазы. Пример, Предложенный способ осуществляется следующим образом.К инкубационной среде, состоящей из раствора трис-НС 1-буфера рН 7,6 0,05 М - 1 мл, калиевой соли глюкоза-фосфата 0,06 М - 0,5 мл, фтористого натрия 0,1 М - 0,15 мл, арсената натрия 0,005 М - 0,1 мл, добавляли исследуемый материал 0,5 мл, инкубировали в водяной бане при 37,5 С в течение разных промежутков времени от 15 мин до 4 час, но более закономерно проявляется активность при 60-минутной инкубации (табл. 1). Реакционная смесь соответствует 2,25 мл. Реакцию прекращали внесением в пробы 2,25 мл 10 О/О трихлоруксусной кислоты. В контрольной пробе трихлоруксусную кислоту добавляли перед внесением исследуемого материала. ЧерезМ 9170 330 мин пробы фильтровали, Влияние концентраций арсената натрия и фтористого натрия на активность неспецифических фосфотаз показано в табл. 2. Таблица 1Активность фосфатаэы глюкозо - 1-фосфата (к. ф.3,1.;3,;10) в свежей и храненной сперме хряка мл отщепившегося фосфата на 100 мл спермы: ПереживаеМОСТЬ, оовремя инкубации в минутах 37,5 С Хранениев часах 90 180 60 120 240 15 30 78,703,% 73,082,98 74,88 д 2,56 54,66 2,27 75,00 1,43 69,50 1,26 63,172,81 49,32 1,34 87,703,55 77,60 3,20 79,67 Ф 3,07 57,44 2,96 24,201,86 19,25 з. 0,85 21,63 1,39 9,200,14 71,90 1,83 71,60 1,78 62,07 1,44 37,56 1,59 39,903,22 36,402,53 36,53 2,13 14,00 1,67 61,903,01 63,00 3,31 50,40 2,50 29,76 1,56 Свежая244896 84 79 73 44 Цифровые данные обработаны статистически по методу М, А, Ойвина (1960)Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 1960, М 4, с. 76 - 85Р=0,95 (РС 0,01) 1000 Х 0,6190х - 0,212 2,920 мг1 К 2 мл трихлоруксусного фильтрата добавляют 2 мл молибденового реактива, смешивают в соотношении 1: 1 5,-ный раствор моли бденовокислого аммония ИН 6 Мо 70 4 НзО с 5%-ным раствором серной кислоты (Нз 804), В качестве восстановителя вносили 1 мл насыщенного раствора тиомочевины (НзСБИН 2), растворяют 9 г тиомочевины в 100 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирок хо- рошо смешивали и ставили в водяную баню на 10 мин при 38 С. После охлаждения до комнатной температуры пробы калориметрировали на ФЭКМ при 590 - 610 ммк (красный светофильтр), Одновременно ставили слепую пробу, где вместо фильтрата брали дистиллированную воду и стандартную пробу с известной концентрацией фосфора. Для приготовления стандартного раствора фосфора брали навеску калия фосфорнокислого однозамещенного (КН 2 РО 4) 0,4394 г и растворяли в 1 л дистиллированной воды, в однолитровой мерной колбе.1 мл раствора содержит 0,1 мг или 100 мкг (микрограмм) фосфора, После по пропорции высчитываем концентрацию фосфора в 1 мл фильтрата, которое умножаем на 4,5з.й получаем количество РО 4. Например, в 1 мл исследуемого материала выявлено 0,6190 мг неорганического 5 фосфата, концентрация спермиев в 1 мл,подсчитанных при помощи камеры Горяева 0,212 миллиарда. Высчитываем по пропорции активность на 109 спермиев.0,212 - 0,619010 1000 - х Если учесть, что 1 спермий хряка имеет 15 125 кубических микрона и полученное количество отщепившегося неорганического фосфата в микрограммах разделить на 125, тогда получим активность, выраженную в микрограммах, неорганического фосфата на 20 з2920 мгмм массы спермиев =23,36 мкг/ммз.Если учесть, что микромоль глюкозофосфата соответствует 31 микрограмму неорганического фосфата, тогда мы делим 25 23,26 мгк31= 0,753 мкм/моль на мм массыспермиев. Кроме того, полученные данные в 1 мл исследуемого материала умножаем на 100 и получаем активность на 100 мл 30 спермы.СЧ о СЧ СО О о со о о сс 0 о со О О О Хо 3 Э3 О о и 0 11 хх 3О С сО Л Я СО Ях ох о 3 со ОСЧ О Ю СО Ж л с 0 3 а, о О ь с 1 СЧ СЧ с 0 О ИО ,ч х ч СО ЭФСО йе Эо л О 2 О Ф ь СО ОЪ СО о СС С 0 С 0 О СЧ с ОЪ о СО СО СО СО О х С, о х э 33 й О сй х 113 3 М и СОо С 0л с О со С 0 СО о СЧ СО СО о СЧ СО ОСЧ .СО О О СО СО СС о л СО О Ч со СЧ сО о СО 3 а о со о О Я ь сО СЧ СО О о СО О с СО О 1 сО СО О 1 О ь сс о сс 0 СЧ СО СЧ О СО С 0 С о С С Щ О СЧ СО сО о Я О 3 О со МЪ оЭ3 3еОхсО33 С.хь СО С И СО о О О СО С сс О л сО СО СО О СО СО ь С 0 СЧ со л со о СО СО С 0 о СО О О О СЧ О СО о СЧ 00 со о СО сО Щ О сО сО О )10 О) со х о Э 3 о и.О с 0 ъх 1 х ,с х 3 к3 - . ох 3 Я ЯОГ СО О сс СЧ 3 а Й о Щ СО о СО О О) О л О т 3 Ю ь Я ь О Ю О СО О СО8 8х о о х х х о х . сС сс ах с о х э о сО о о СЧ СЧ о я о о о л х х хх ох х С о х ххх О о СЧ х х х ь р Щ ч 8 оч Х О хя хе ф о с,о хх хЯ И о ф. хЫ х о сО ЧсО хохс Х ХС 0 ххэ х 3:,кх х оРх эх Ф 333офоФХйр,хочххо ч-нцн. иэн,аО ноякдх су хСоМ Э3 3лоСО11 Й3,ц 0Мо 3ЖЯ СОохох х о Э м и що О,"Х СЧ Х ц;) й 1 с3 и сс 03 О СО О, СЧ охх о С Э ы 3 3 о О О СОхх 3С 3 о - х м; 3 со Яол оо х2 819170 со Сб СЧ ЮСоставитель А, Макаров Корректор Л. Слепая Редактор Л, Курасова Техред И, Заболотнова Заказ 642/17 Изд.258 Тираж 530 Подписное НПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5.Типография, пр, Сапунова, 2 Способ определения активности глюкозо-фосфатазы (к. ф. 3.1.3.10) в сперме, преимущественно хряков, включающий введение пробы спермы в реакционную смесь, содержащую трис-НС 1-буфер, калиевую соль глюкозо-фосфата с последующим инкубированием, добавлением раствора трихлоруксусной кислоты для прекращения реакции, отличающийся тем, что,с целью повышения точности определения активности, перед введением пробы спермы в реакционную смесь вносят фтористый натрий и арсенат натрия при следующем 5 соотношении Компонентов, мкг/мл:Фтористый натрий 139,97 - 279,93 Арсенат натрия 34,67 - 69,33Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 10 1. Асатиани В. С, Ферментные методыанализа, 1969, с. 503 в 5 (прототип).