Способ определения гетерозисного эффекта у гибридов первого поколения

Соеэ Советски кСоциалистическихРвстгублик ОП И(;.;,;ИЗОубликован К 631.5 (088.8) ата опубликования описания 05 03.8 2) Автори изобретени а и Р. Т. Али.Зад) Заявител 4) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕТЕРОЗИСНОГО ЭФФЕКТА У ГИБРИДОВ ПЕРВОГО ПОКОЛЕНИЯ( в мг %)атели ДНК- экси.рабоИзобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции сельскохозяйственных растений,Известны способы определения гетерозисногоэффекта у гибридов первого поколения, по ко5торым определяют содержание нуклеиновыхкислот, в частности дезоксирибонуклеиновойкислоты (ДНК), по величине которых судято наличии гетерозисного эффекта 111 и 121.Недостафами таких способов являются не 0обходимость закладки полевых опытов и длительность определения конечных результатов,Целью изобретения является сокращениесроков определения наличия гетерозисиого эф.фекта и исключение закладки полевых опьпов.5Цель достигается. тем, что содержание"ДНКопределяют в колеоптилях трехдневных проростков и по увеличению ее количества в клет.ках гибридов по сравнению с их родителямисудят о наличии гетерозисного эффекта.Способ осуществляется следующим образом.Семена гибридов и их родителей проращивают в питательном растворе Кнопа. У трех.цневных проростков снимают колеоптили, в которых определяют содержание ДНКи число клеток, а полученные показпересчитывают на одну клетку,Для определения содержания ДНК колеоптили в количестве 2 г (свежего веса) гомогеии.зируют 10 мл холодного 95%.ного этанола,затем гомогенат переносят в центрифужныепробирки, добавляют еще 10 мл холодного95%-ного этанола и центрифугируют. Центрифу.гат отбрасывают, Осадок промывают следующимиреактивами по 20 мл каждого: 95%-ным этанолом - 1 раз при комнатной температуре;50%-ным этанолом, подкисленным ледяной ук.сусной кислотой до рН 4,5 - 2 раза при комнатной температуре; 0,2 н. НС 104 - 2 раза нахолоде; 95%.ным этанолом - 1 раз при комнатной температуре; абсолютным этанолом сэфиром (3:1), прокипяченным с обратным хо.лодильником 3 мин - 2 раза; эфиром при комнатной температуре - 1 раз.Далее осадок высушивают в вакуумкаторе и взвешивают. Предварительно обтанный материал суспензируют 5 мл 0,3 н.ораствора йаОН и инкубируют при 30 С в те.719566 Для каждой пробы получают 24 цифрыс учетом биологических повторностей, что дает72 измерения для каждого варианта. Получен.ные данные подвергают математической обра.боткеУстановив число клеток на единицу свежеговеса образца соответственными подсчетами по.казателей нуклеиновых кислот в мг % свежего(веса, пересчитывают количество ЛНК на однуклетку.Полученные данные по содержанию ДНК всоматической клетке гибридов пшениц и ихродителей приведены .в нижеследующей таблице.Показатели, данные в графах 3 и 4 этой таблицы, характеризуют продуктивность одногорастения и гетерозисный эффект у гибридов,25 Приведенные в таблице данные свидетель.ствуют об увеличении количества ДНК в сома.тической клетке проростков гетерозисных гибридов. При этом установлена прямая связь междууровнем гетерозиского эффекта и степенью3 о увеличения ДНК в клетке. 1 ак, например,гибрид Эритроспермум х ферругинеум (Е,) повесу одного колоса и по весу зерна в одномколосе резко отличается от своих родителей.У этого гибрида в соматической клетке содер 35жится больше ДНК, чем в клетке родителей,Гибрид ферругинеум х Эритроспермум попродуктивности не резко отличается от родителей,В соматической клетке этого гибрида количество ДНК увеличивается также не резко,Таким образом, в соматической клеткею гетероэисного гибрида Гюргянах Эритролеу.кон, отличающегося высокой продуктивностью,содержится больше ДНК, чем в соматическойклетке родительских форм, а у гибрида ЭритроДля 45 слермум х Элитролеукон при заметно низкомгетерозисном эффекте количество ДНК в со.матических клетках увеличивается слабо, Всеэто доказывает наличие связи между уровнемгетерозисного эффекта у гибридов и степеньюувеличения количества ДНК в соматических1 клетках.Использование предлагаемого способа определения гетерозисного эффекта у гибридов первого поколения по содержанию ДНК в осмоти.ческих клетках проростков обеспечивает полу 55чение ожидаемого эффекта за очень короткоевремя, исчисляемое днями, отменяет необходимость в проведении длительных полевых опытов,требующих месяцы, а иногда и годы,3чение 18 ч, Гидролизат центрифугируют и оса.док. промывают 5 мл 0,3 н, раствора МаОН.Экстракт и промывной центрифугат соединяют и к ним приливают 0,3 н. раствор йаОН до10 мл. Осадок отбрасывают. Соединенные экстракты подкисляют 15%.ной НС 104 до рН 1,выдерживают 40 мин при 4 С и, центрифутируют. Центрифутат добавляют к фракции ДНК,Общий объем экстракта доводят, водой до25 мл.Осадок ДНК - протеин суспензируют 3 мл0,5 н. раствора НС 10; нагревают на бане до70 С и выдерживают при этой температуре15 мин. Затем охлаждают и центрифугируютпри .2 С. Осадок протеина промывают 2 млхолодного 0,5 н. раствора НС 104 при 2 С,центрифугируют и промывной центрифутатсоединяют с основным экстрактом, Общийобъем экстракта доводят 0,5 н. растворомНС 104 до 5 мл.Раствор ДНК замеряют на спектрофотометре против 0,5 н. раствора НС 10. Затем проводят при длине волны 270 и 290 нм.Расчет количества ДНК (в мг/мл) производят по формуле:Е 1 о - г 9 о10,1,0,19 пгде Е - " оптическая плотность;и - вес навески, мг;0,19 - постоянный эмпирический выведенный коэффициент;10,1 - постоянный коэффициент для ДНК,Число клеток определяют путем мацерациикусочка ткани хромовой кислотой с последующим подсчетом в капле взвеси числа клетокв счетной камере Фукса Розенталя под микроскопом. Для каждого объекта подбираютконцентрацию хромовой кислоты и время ма.церации, поскольку превышение оптимальныхдля мацорации условий приводит к разрушени. клеток. цля листьев пшеницы достаточно10%-ной хромовой кислоты в течение 18 ч.Количество взятой хромовой кислоты эави.сит от количества мацерируемых кусочков.мацерации одного колеоптиля достаточно 1 млее. Перед подсчетом следует тщательно потрясти содержимое пробирки, чтобы получиласьравномерная взвесь клеток, Если она слишкомгустая, ее разводят водой. Удобно считать количество клеток в взвеси такой густоты, чтобьв поле зрения (в одном большом квадратекамеры) было 30-50 клеток.Подсчет проводят в четырех больших квадрате, взятых по диагонали счетной камеры вверхней к нижней сетках, После этого камерупфомьвают,вытйрают, заполвпбт и вновьподсчитывают в четырех больших квадратах вкаждой сетке. Эта же операция повторяется 4 и в третий раз Таким образом, просчитываютсяпо 24 квадрата из каждой пробирки,Полученные цифры по количеству клеток в одном большом квадрате пересчитывают на5 -объем всей имеющейся в пробирке взвеси клеток и затем вычисляют число клеток вовзятом отрезке.(ф 3 сч . 4 сч еи фи сч ч сч 3 О 8 3 Р 8Фсч сч и ч епеч м м ФСЬ о оЯо орй фо8оЫоо ф а счЧ, о ФФ +,О 00 счо в о о л Ч 3 БС 4Ф Ф ю о м +Чф) Ф8 ФСоставитель Л, МарченковаРедактор В;Бородкин, Техред Н,КовалеваКорректор М. Демчик Заказ 10094/3 Тираж 723 Подписное Е 1 ЬЙИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д, 4/5фйлиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул, Проектная, 4 л:., ", . 71956РФ о р м у л а из о б р"6 т"е н-и я Способ определенйягетерозисйого эффектау гибридов первого поколенвглтем "офеделе " ййя "удержания в" соматических клетках гибридов й их родителей дезоксирибонуклеиновойкислоты, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью сокращения времени определения пали.чия гетерозисйого эффекта и исключения заклад.ки полевых опытов, содержание дезоксирибонуклейиовой кислоты определяют в колеопгилях трехдневных проростков и по увеличениюее количества в клетках гибридов по сравнению с их родителями судят о наличии гетерозисногоэффекта,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Али.Заде М. А Алиев Р; Т. Изменениесодержания нуклеиновых кислот у гетерозисныхгибридов пшеницы. Извеетие АН Азербайджан.ской ССР, Серия биологических наук,.1973,5 Р 4,2, Али-Заде М. А., Алиев Р, Т, Увеличениесодержания ДНК в клетке гетерозисных гибридов пшенйцы. Доклады АН АзербайджанскойССР,1973, М 29, йе 1 (прототип).