Способ определения перекиси водорода

ен но тОП ИСАНИ Е 1680635 Союз Советскни Соцналнстнческнх Республнк) Р 2460903,8 енный комитетССРизобретенийоткрытий арс Г 33) по дел и) УДК 543-4.05 :661.491 ,(088.8) 08, 79. Бюлл ата опуб исания 25. вани 2) Авторы изобретения Иностранцыйн, Вальтер РиттеФогель и Вольфганг(ФРГ) В ер Гют Петер орф, Хуго Тидеманн,рнер Иностранная Фирма фБерингер Маннхайм ГМБХф7) Заявител 4) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОД тся к об а именно пределен динений, которых астик спо я пер при бразу Поскол шое значе диагности реакций в зываемые которым м но и каче ты реакци Изобретение относаналитической химии,собам обнаружения икиси водорода или совступлении в реакциюется перекись водоро окисленияестен спосо ия перекиси в качествео бензидикаторы об, Иэв ределен некием окислог Известны инди длэтих экспресс-пр бобнаружения и опводорода с примеиндикатора солянна 1),Однако известный индикатор облаает недостаточными чувствительностстабильностью,Наиболее близким по техническойсущности и достигаемому результатуявляется способ обнаружения и определения перекиси водорода с применением в качестве индикаторов скис"ления соединений ряда бенэидинов, аименно о -толидинов 2),Несмотря на широкое распространение этих индикаторов, О -толидиныимеют свои недостатки,Так, компоненты в рецеэкспресс-проб не всегда соптимальных количествах,16 и 5 птурах дляодержатся в что привоРеакция перекиси водорода с инди каторами окисления при катализе бла годаря пероксидазе или веществам, действующим как пероксидаза, играет особую роль в аналитической химии для красящих соединений, благодаря которой помимо обнаружения перекиси водорода и пероксидаз определяется также ряд веществ, реагирующих с ки лородом и оксидазой с образованием перекиси водорода, Далее в качестве примеров перечислены некоторые .иэ этих веществ, в скобах приведены со ответствующие им оксидазы: глюкоза (глюкозаоксидаза, галактоза, галакт заоксидаза), 1,-аминокислота (Ь-аминокислотаоксидаза), холестерин (холестериноксидаза) и мочевая кислота (урикаэа). Это прежде всего вещества, обнаружение и определение которых имеет большое значение в медицинской диагностике и пищевой промышленности. ку эта реакция имеет больие в медицинской ускоренной е, почти для всех названных ажное значение имеют так накспресс-пробы, благодаря жно определить количествентвенно отдельные компоненЗгде ВК ,В ,24 - одинаковые или раз 35ные радикалы, представляющие собойпростые или разветвленные цепи низших алкильных групп с 1-6, предпочтительно с 1-4)атомами углерода.Отличие способа состоит в приме Онении 3,3,5,5 -тетраалкилбензидиновобщей формулы , в качестве индикаторов окисления в экспресс-пробах дляобнаружения иопределения перекисиводорода, соединений, котсрые взаимодействуют с образованием перекисиводорода и соединений, ведущих себя,как перекиси.Способы получения соединений форлы ; известны. 5 ОНе описанные в литературе соединения, З,З -диметил,5 -диэтилбензидин и 3,3,5,5-тетраизопропилбензидин могут быть получены из О-толидина и этилена или бензидина и пропилена,По изобретению тетраалкилбензидины могут быть применены для обнаружения глюкозы и крови в моче, холестерина в сыворотке, перекиси водорода в молоке или в пленках для проб 6 Одля определения глюкозы в крови исыворотке и во многих других пробах.Все эти пробы отличаются тем, чтоцветные реакции ярче, стабильнее илучше оттенены, чем при применении 65 му 3 68063 дит к появлению нежелательных окрашиваний и потере чувствительности при длительном хранении. Кроме того, катион радикала зелено-голубого цвета, образующийся при вступлении в реакцию с индикатором, не очень стабилен, так как при дальнейшем окис ленни относительно легко переходит в хинодиимин коричневого цвета. Поэтому окраска анализируемых проб вследствие образования коричневого оттенка имеет нечистый тон, который быстро меняется и поэтому уже через непродолжительное время его нельзя правильно оценить. Хотя катион радикала может быть стабилизирован в значительном",объеме анионными смачивателями, последние не всегда применимы, так как они могут разрушать оксидазы уже на первой стации реакцииеЦелью изобретения является получение экспресс-проб, которые имели бы устойчивые радикалы красящих веществ.Поставленная цель достигается описываемым способом определения перекиси водорода, включающем образова 1 ние окрашенного соединения с применением в качестве индикаторов окисления 3,3 ,5,5 -тетраалкилбензидиновобщей формулы300,5 г 12,7 г30,0 млДо 100 о - то лидина, так к ак окраска катионоврадикала тетраалкилбензидинов от зелено-голубой до зеленой не загрязняется примесью коричневых хинондииминов. В экспресс-пробах, описанных в примерах, четко проявляютсясвойства тетраалкилбензидинов, причем у отдельных представителей этихсоединений наблюдается по сравнениюс О-толидином повышенная стойкость,например, при хранении индикаторнойбумаги для обнаружения крови в моче.Благодаря повышенной стабильностикатионов радикалов в пробных пленкахпри определении глюкозы анализ возможен в достаточно большой промежуток времени.П р и м е р 1. Пробная бумагадля обнаружения крови в моче,Фильтровальную бумагу (Шляйхер иИюль Р 23 ЯЬ) последовательно пропитывают в растворах 1 и 2 и высушивают при 40 ОС,Раствор 1.1,2 М буферный раствор цитрата( .70-ная) 1,6 гТриморфолид фосфорнойкислотыЭтанолдистиллированная вода млРаствор 2,3,3,5,5 -тетраметилбензидин 0,3 гФенантридин 0,2 гТолуол До 100 млДля пробы применяют белую бумагу,которая окрашивается в зелено-голубой цвет при погружении в мочу, содержащую кровь, спустя 5-20 с. Еслиэритроциты в норме., то бумага окрашивается в зелено-голубой цвет. Еслипроисходит гемолиз или в моче находится гемоглобин, то бумага тотчасже окрашивается также в зелено-голу-.бой цвет, Чувствительность 5 эритроцитов/ммили соответствующего количества гемоглобина. Количество эритроцитов ниже нормы также может вызвать при известных условиях появление отдельных зелено-голубых точек на пробной бумаге, Чувствительность по миоглобину соответствуетчувствительности по гемоглобину,После. трехдневной выдержки при 60 Спробные бумажки окрашиваются в желтоватый цвет, их чувствительность восновном остается прежней, а стремяреакции увеличивается на 60-90 с.Пробная бумага, пропитанная о -толидином, после такой же выдержки, какпри пропитке тетраметилбензидином,елты Светло-зелены ветло-эе Зелено-голу редне-зелееленый й ГолубоватозеленыйЧерно-голубой 5 о лено-г Голубовазеленый 500 мно-зелены Густой 000 ный. ерны ерно-оливко торые ства на по ки не итанн 0 500 мг 100 мл а для ет в в ке, зе и при е р 4. Бумага ения холестерн холестерина в альную бумагу Инд) пропитыв деленной после вают при темпедля проб на и сложсыворотке. (Шляйхер и аютраство- довательносо ратуре 40 С. обнару эфиров Фильтро ,ь 597 МР и в опр и высуш дл ны 65 т 5 6806окрашивается в желто-коричневый цвет,ее чувствительность 20 эритроцитов/щ Бумаги такой же чувствительности и стабильности, которые взаимодействуют медленнее и дают чисто-зеленый цвет, получают при применении эквимолярных количеств 33 55-тетраэтил.-3,3 -диметил 5,5 -диэтил- или 3,3,5,5-тетраизопропиленбензидинов. П р и м е р 2. Бумага для проб 1 Одля обнаружения глюкозы в моче. Фильтровальную бумагу (Шляйхер и 1)юль 597 НР) пропитывают в растворах 1 и 2 и сушат при 50 С. 15Раствор 1.Глюкозаоксидаза(70 об/мг) 222 мгПероксидаза (70 об/мг) 28 мгМорфолиноэтансульфанат-буффер (рН 61 ОМ) 50 млТатразин 80 мгПоливинилпирролидин 300 мг дистиллированная вода до 100 мл Бумажки для проб, ко содержат эквимолярные количе 3, 3-диметил-диэтилбензиди устойчивости цвета практичес отличаются от бумажек, проп ых тетраэтилбенэидином,П р и м е р 3. Бумажки для пробдля обнаружения перекиси водорода.фильтровальную бумагу пропитываютв растворах 1 и 2 и высушивают при40 С.Раствор 1.Тринатрийцитрат,дигидрат 225 мгЛимонная кислота,моногидрат 175 мгПероксидаза (70 об/мг) 50 мгАльгинат натрия 150 мгПолиоксиэтиленсорбятанмонолаурат (твин) 1300 мг Раствор 2.33 55 -тетраметилбензидин 600 мг Этанол До 100 мл Бумажки для проб, которые содержат эквимолярные количества 3,3,5,5--тетраэтилбензидина или О-толидина получают по методике примера 1. Цвета реакций этих бумажек в моче, содержащей глюкозу, через 60-120 с после погружения приведены в таблице. При применении тетраметилбензидина эти цвета не изменяются 10-15 мин, при сушке они приобретают более голубоватый оттенок и остаются такими в течение всего дня.Цвет пробной бумаги, пропитанной тетраэтилбензидином, при сушке слегка бледнеет, и остается таким не(- сколько дней, Пробная бумага, пропитанная.О-толидином, через 5-10 мин желтеет и бледнеет, а после сушки в течение 2-4 ч после концентрации глюкозысовершенно бледнеет или окрашивается в слабый коричнево-оливковый цвет. Винилпирролидин-винилацетат-Иишполимеризат .Дистиллированная вода Д Раствор 2,3,3,5,5-тетраметилбензидинАцетон ДоТак, приготовленная бума проб с перекисью водорода д ных растворах, например мол лено-голубые цветовые реакц концентрациях менее 0,1 мг(18 об/мг)0,25 гПероксидаза (70 об/мг) 0,05 гДистиллированнаявода До 100,0 млРаствор 2.З,З,5,5-тетраметилбензидин 0,28 гЭфир полиэтиленоктилФенола (Тритон х 100) 0,5 гМетиленхлорид. До 100 млТаким образом, бумаги для проб реагируют с сывороткой, которая содержит холестерин и/или эфир холестерина, с образованием зеленых тонов, соответствующим интенсивности концентрации холестерина. Соответствующиепробные бумажки, которые содержатвместо тетраметилбенэидина О -толидин, взаимодействуют также с образованием зеленых тонов, однако они менее интенсивны,П р и м е р 5. Способполучения3,3 ,5,5 -тетраиэопропилбенэидина.(Раствор 100 г 2,6-диизопропилани,лина в 1280 мл воды и 10 мл концентрированной соляной кислоты (уд. вес1,18) нагревают до 90 С и быстро приливаютв нагретый до 97 С раствор желеэосинеродистого калия (111) в5100 мл воды и 143 г едкого натра. Всвязи с выделением синильной кислотыработы следует вести при хорошей вытяжке, Образующуюся красного цветасуспензию перемешивают 15 мин, охлаждают и экстрагируют эфиром (б хх 300 мл), Эфирные экстракты сушатнад сульфатом натрия, отсасывают,упаривают, Получают 97 г азосоединения в виде красного масла, При хроматографическом разделении на колонке с силикагелем (высота 110 см, диаметр колонки 8 см) системой хлороформ-.лигроин, взятых в соотношении1:4 (силикагеля 1,5 кг с диаметромчастиц 0,05-0,2 ьм) получают 32,4 гкристаллов кирпично-красного цвета,т,пл, 134-136 С.Азосоединение растворяют в 500 млледяной уксусной кислоты, загружают150 г цинковой пыли и нагревают полчаса при температуре кипения, с обратным холодильником. Затем отсасывают избыток цинковой пыли, растворитель упаривают под вакуумом. Получают 17,5 г бесцветных кристаллов,которые перемешивают со 1"1 мл воды,0,1 г 5 30 15 20 25 30 35 40 лиал ППП Патент ЦНИИПИ Заказ 4681/5 приливают 150 мл 2 н. едкого натра и трижды экстрагируют порциями ,по 150 мл хлороформа. Получают 12,4 г неочищенного 3,3 ,5,5 -тетраиэопро/пилбензидина. К нему добавляют 90 мл уксусного ангидрида, быстро доводят до температуры кипения и избыток уксусного ангидрида отгоняют в ротационном испарителе. Полученный остаток растворяют в 20 мл иэопропанола, приливают 180 мл лигроина и отсасывают образовавшиеся кристаллы. Полученное М,И-диацетилпроиэводное перекристаллиэовывают иэ изопропанола-.лигроина (2:1)Получают 7,6 г бесцветных кристаллов с т.пл. 366 ОС, Для отщепления И-ацетильных групп их нагрева-. ют в смеси 180 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл концентрированной соляной кислоты в автоклаве, в течение б ч при 130-140 С, Затем реакционный раствор упаривают, остаток обрабатывают 200 мл 2 н. едкого натра и выделившееся основание экстрагируют хлороформом, 4 х 50 мл. Хлороформные экстракты сушат над сульфатом натрия., отсасывают, упаривают, Получают 3,3 ,5,5 -тетраизопропилбензидин в виде коричневатого масла. Вйход 5,6 г (молекулярная масса 352) . Дигидрохлорид (С 4 НЗ М 2 НС 6) плавится при 263-265 СС (с раэл.),Формула изобретения Способ определения перекиси водорода или соединений, ведущих себя как перекись водорода, включающий образование окрашенного соединения при взаимодействии с индикатором окисления, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью проведения экспресс-анализа, в качестве индикатора окисления используют 3,3 ,5,5 -тетраалкилбецзидины общей Формулы где В Н 2, В,В- одинаковые или разные радикалы, представляющие простые или разветвленные цепи алкильных групп с 1-4 атомами углерода.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. У. Шамб, Сеттерфилд Ч. Перекись водорода ., изд, И-ИЛстанной литературы, М., 1968, с, 455-457,2, Кульберг Л., Матвеев Л., ЖПХ,9, 755, 1936 (прототип). Тираж 591 Подписное жгород, ул.Проектная