Способ получения алкалоидов спорыньи
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Текст
1О П И С А Н И Е 1 п) 562205ИЗОБРЕТЕНИЯ Союэ Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 20,07.73 (21) 1952210, (23) Приоритет - (32) 21.07.72 сударствениый комитет вета йинистров СССР о делам иэобретеиийи открытий 3) В(31) К 1 - 47 3) УДК 612,393(08 15.06.77. Бюллетеньнация описания 28.09,77 пуоликован ата опубли 2) Авторы изобретспи Иностранцыадь, Денеш Секель,рдь-Надь и Эржебет(ВНР) жеф Со ка еза Вак, Лаиош Эва УдИностранное предприятие Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр РТаявптсль ОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ СПОРЪНЪ(54) СПОСОБ П1Изобретение относится к вопросу получения алкалоидов спорыньи ферментативным путем.Известен способ получения алкалоидов спорыньи, предусматривающий выращивание культуры С 1 алсерз рцгрцгеа в аэробных условиях на жидкой питательной среде, в состав которой, входят источники углерода, азота, минеральные соли, и последующее выдсление из культуральной жидкости продукта,Получаемые по этому способу алкалоиды спорыньи (пептидного типа) плохо растворимы в водс, а сам ферментативный процесс их получения недостаточно хорошо воспроизводится.Циклическая боковая цспь аклалоидов пептидного типа, состоящая из трех аминокислот, усложняет процесс биосинтсза,Кроме того, плохо растворимые,в воде алкалоиды накапливаются в клетках. Плохая растворимость алкалоидов в воде отрицательно сказывается как на образовании алкалопдов, так и на выделении их пз культуральной среды,Чтобы повысить эффективность процесса получения алкалоидов спорыньи, к питательной среде добавляют источники азота, например аспарагин, комплексные источники азота природного происхождения (экстракты дрожжей, пептоны). Однако это приводит к значительному ускорению роста микроорганизмов, а быстрорастущие культуры производят в очень малых количествах такие продукты метаболизма, как алкалоиды спорыньи, По слсднпс образуются во время так называемого вторичного обмена веществ, т. е. когда рост микроорганизмов замедляется. Накопление алкалоидов пептидного тппа в клетках микроорганизмов приводит к тому, что часть 10 липидного и пигментного содержимого клетоктоже псрсходит в экстракт. 1 Лз целевого продукта пх трудно удалить, так как по условиям растворения и распределения эти компоненты близки к алкалопдам спорыньи.15 Снижение содержания фосфора в питательной среде до малой концентрации (0,25 г дигидрофосфата калия на 1 л) способствует снижению скорости роста микроорганизмов, однако, это в свою очередь приводит к интен спвному образованию пигмента.Для повышения выхода препарата по предлагаемому способу получения алкалоидов используют штамм С 1 а.лсерз рцгрцгеа ОК 1 88/192. Этот штамм образует в процессе 25 культивирования на среде с повышенным содержанием фосфора алкалоид пептидного типа, при этом скорость образования алкалоида относительно высока, максимальное количество его накапливается на шестой, седь мой день культивирования.562205 Таблица 2 15 Содержание алкалоида на 7-ой день/млИсточники азота 20 Аспарагии Г(ептон 402 3,0 3,0 3,0 ЗО Казеин Концентрировавнгяй 25 отвар зернаНитрат аммония (контроль) 1042 3,0 Таблица 1 50 Таблица 3 Удельноо содержание аткатоида мг/гОтносительное количество алкалоидовпвптидного типа на седьмой день, 00 Содержаниеалкалоидапа седьмой день,Т/мл Нитратаммония, г/л 0 8,6 8,6 13,0 20,6 31,5 30,4 0 1 2 5 0,3 0,7 1,22 1,68 2,18 2,65 2,82 0 60 105 220 418 834 858 52 66 71 69 61 64 1072 1482 1530 1121 1036 981 2,0 З,О 6,0 10,0 15,0 60 Йспользуемый согласно предлагаемому способу штамм культуры С 1 алсерз рцгрпгеа был выделен следующим образом. Исходную культуру С 1 алсерз рпгрцгеа культивировали на с 1 его 1 шп с высоким соде 1 эн(анисм алкалоида, Были использованы три стадии инокуляции в повторных циклах. В отдельных циклах материал получали на жидкой питательной среде, используя колонии, снятые с твердой питательной среды. После этого, используя полученный инокулянт, готовили жидкую культуру, продуцирующую алкалоид. Клетки, полученные на этой стадии, вновь трансинокулировали на твердую питательную среду, К каждой порции питательной среды добавляли 1,0 - 10,0 г/л нитрата аммония.К жирной питательной среде добавляли 0,5 г/л дигидрофосфата калия и 20,0 г/л хлористого натрия.Те культуры, которые на шестой или седьмой день культивации продуцировали наиболее подходящее количество алкалоидов пептидного тппа, пересевали на твердую питательную среду. В результате выделили штамм С 1 алсерз рцгрцгеа ОК. 88/1972, который хранится под указанным номером в национальном институте здравоохранения в Будапеште.Для идентификации этого штамма берут во внимание его следующие морфологические и биохимические признаки. Морфологические признаки колонии, образовавшейся на питательной среде ЯС 101 после инкубационного периода в 30 дней, следу;ощпе: чсгко ограниченные растущие радиально складчатые оони диаметром 25 - 30 мм. Бархатисто-белая поверхность со светло-бежевым центром и коричневатой внутренней стороной. С поверхности агара твердые колонии снимаются трудно. Под микроскопом клетки, образующие колонию, выпуклые, хрупкие, зернистые.После культивации культуры на питательной среде ЬВ 203 ока окрашена в свстло-бежевый цвет, напоминает пух. од микроскопом клетки культуры образуют сильно преломляющие, разделенные пере городками прямые черточки с небольшим количеством ответвлений толщиной 4 - 5 мкм. По мере старения клетки становятся выпуклыми и зернистыми, Данные по росту штамма н образованию им алкалоида на питательной среде 5 В 203 приведены в табл. 1.Влияние органических источников азота на ооразование штаммов алкалоида приведено в табл. 2. Влияние нитрата аммония на образованиештаммом алкалоида приведено в табл. 3.Для того чтобы выделить и идентифицировать адкалоиды, питательный бульон экстрагировали смесью хлороформа и изопропилового спирта в отношении 4: 1, Экстракт, содержащий алкалоиды, хроматографировали в слое окиси алюминия. Отдельные компоненты вымывали и определяли их концентрацию по УФ-поглощению, используя в каждом 40 опыте идентичные известные стандарты.Полученные при помощи штамма алкалоиды имеют состав, %: эргокриптинина 5, эргокорнинина 4, эргокриптина 30, эргокорнина 28, эргозина 5, эргометринина 4, эргометрина 22, другие растворимые в воде алкалоиды 2.Таким образом, штамм С 1 аисерз рпгрцгеаОК 1 881972 является разновидностью, полученной без мутагенной обработки. Он спосо 562205бен продуцировать алкалоиды в условиях сапрофигина. При его содержании в питательной среде 0,01 - 1,0% нитрат аммония оказывает не замедляющее, г ускоряющее действие на рост штамма и на образование им алкалоида. В образующих алкалоид питательных средах не наблюдалось образования темно- фиолетового пигмента, характерного для штаммов Саисерз. Максимальное количество алкалоида образуется на шестой - седьмой день культивации. На седьмой день культивации количество мицелия было ниже 3,5, а относительное образование алкалоида, рассчитанное на сухие клетки, составляло 30 мг/г; 60 - 70% полученных таким образом алкалоидов состоит из двух компонентов группы эрготоксина и их изомеров соответственно практически в одинаковых соотношениях.Таким образом, предлагаемый способ относится к ферментативному процессу получения алкалоидов спорыньи, главным образом эргокриптина и эргокорнина, путем культивации указанного штамма на жидкой, подвергнутой аэрации питательной среде, содержащей сахарозу, неорганический источник азота и другие известные добавки.Предлагаемый способ обладает по сравнению с известными многими преимуществами, Так, он имеет хорошую воспроизводимость, При удалении органических источников азота из питательной среды и замене их нитратом аммония воспроизводимость может бытьулучшена еще больше, экономичность процесса при этом повышается.Продолжительность процесса 5 - 6 дней, в то время как продолжительность известных способов 8 - 12 дней.Ллкалоиды свободно выделяются из питательного бульона,Образующиеся алкалоиды имеют в питательной среде удачное соотношение: алкалоиды, принадлежащие к группе эрготоксина, образуются в равных количествах, так что при отделении этих двух алкалоидов и при добавлении к полученной смеси эргокриптина эрготоксин может полностью вступать в соединение с обычным соотношением компонентов. Кроме того, при получении алкалоидов спорыньи образуется эргометрин - наиболее важный сопутствующий алкалоид, растворимый в воде. Этот алкалоид легко извлекается в процессе работы и выделяется самостоятельно,Пример 1. Типичную колонию штамма С 1 айсерз ОК 1 Мо 88/1972 в возрасте 30 дней снимают с поверхности твердой питательной среды ЬС 101 и гомогенизируют в 10 мл стерильной воды. 100 мл питательной среды 32 С, помещенные в колбу Эрленмейера на 500 мл, прививаются этой суспензией. Питательная среда 52 С имеет следующий состав, г: сахароза 200,0 лимонная кислота 15,0, дигидрофосфат калия 0,5, сульфат магния 0,3, гидроокись аммония до рН 5,2, вода до 1000,0. 5 10 15 20 зо 35 4 О 4 д 50 55 6 О о 5 6Культуру встряхивают при 24 С в течение 6 дней, затем отбирают фракцию 10 мл, которую далее используют для прививки 100 мл питательной среды ЬВ 101, помещенной в колбу Эрленмейера на 500 мл. Питательная среда ЬВ 101 имеет следующий состав, г: сахароза 100,0, янтарная кислота 10,0, нитрат кальция 1,0, нитрат аммония 1,0, дигидрофосфат калия 0,5, сульфат магния 0,3, хлористый натрий 10,0, гидроокись аммония до рН 5,2, вода до 1000,0.Культуру встряхивают при 24 С в течение 7 дней. Содержание сухого материала в культуре составляет 3,42%,100 мл культуры, полученной как описано выше, экстрагируют 50 мл смеси хлороформа и изопропилового спирта, взятых в соотношении 4: 1, 10 мл экстракта выпаривают, остаток помещают в 1 мл смеси хлороформа и метилового спирта 1;1 и раствор хроматографируют в слое сухой окиси алюминия, Пятна алкалоида обнаруживаются в Уфсвете; их вымывают 50"/о-ным раствором ме. тилового спирта в воде, содержащим 1% винной кислоты; количество соответствующих алкалоидов определяют по УФ-поглощению,Полное содержание алкалоида в культуре составляет 1687 у/мл в то время, как содер. жанне из эргокорнпна - эргокриптина до стигает 1187 р/мл.Эргокриптин и эргокорнин могут быть выделены в кристаллическом виде из любой культуры известными методами,Пример 2, Штамм и твердая питательная среда из агара те же, что в примере 1. Связанный слой мицелия около 150 см. Культуру в возрасте 30 дней извлекают с поверхности твердой питательной среды из агара, Вещество суспендируют и гомогенизируют в 100 мл воды.Из полученной таким образом суспензии отбирают фракции по 20 мл и используют их для прививки двух колб Эрленмейера на 750 мл, содержащих по 200 мл питательной среды 5 С 100. Состав питательной среды 5 С 100 следующий, г: сахароза 100,0, лимонная кислота 10,0, сульфат магния 0,3, дигидрофосфат калия 0,5, хлористый натрий 10,0, гидроокись аммония до рН 5,2, вода до 1000,0.Смесь встряхивают при 24 С в течение 6 дней, после чего 400 мл полученного таким образом привитого материала используют для инокуляции 6 л питательного бульона ЬВ 103, помещенного в лабораторный ферментер на 10 л. Состав питательной среды ЬН 103 следующий, г: сахароза 100,0, янтарная кислота 10,0, хлористый натрий 10,0, нитрат аммония 3,0, нитрат кальция 1,0, дигидрофосфат калия 0,5, сульфат магния 0,3, гидроокись аммония до рН 5,6, вода до 1000,0.Этот питательный бульон перемешивают при 25 С со скоростью 240 об/мин и насыщают воздухом со скоростью 0,5 л воздуха/л56225 Формула изобретения Составитель М. Андреева Тсхред 3. Тараненко Корректор Л. Котова Редактор Л. Емельянова Заказ 1691/9 Изд Лго 554 Тираж 563 Подписное НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5,мин. Ферментация продолжается 5 дней. Содержание сухого материала в полученном таким образом питательном бульоне 3,14%. Общее содержание алкалоида, определяемое по методике, описанной в примере 1, составляет 1046 у/мл. Содержание эргометрина достигает 310 у/мл, содержание эргокорнина - эргокриптина 636 у/мл. Питательный бульон обрабатывают, как описано в примере 1.Пример 3. Используя штамм, идентифицированный в примере 1, получают слой мицелия на твердой питательной среде ЯВ 010 при инкубации в течение 30 дней. Состав питательной среды 8 В 010 следующий, г: сахароза 100,0, янтар.ная кислота 10,0, нитрат аммания 10,0, нитрат кальция 1,0, дигидрофосфат калия 0,25, сульфат магния 0,25, гидроокись аммония (до рН 5,2), волокиистый агар 25,0, вода до 1000,0.Культуру, выделенную с поверхности агара, используют для приготовления прививочного материала, как описано в примере 2, с иопользованием питательной среды ЯС 100. На 6-ой день культивации порциями по 400 мл полученного инокулята прививают по 6 л стерильной питательной среды ЯВ 101, помещенной в ферментер на 10 л, Культивация продолжается в течение 5 дней, как описано в примере 2. На этой стадии полученные питательные бульоны объединяют, и этот инокулят (18 л) используют для прививки 200 л жидкой питательной среды 8 С 101, помещенной в ферментер опытной установками на 300 л. Эта среда не содержит волокнистого агадира, в остальном она имеет вышеуказанный состав. Питательный бульон перемешивают со скоростью 300 об/мин и насыщают воздухом со скоростью 9 мз/ч.5 Ферментация продолжается в течение6 дней при 25 С. На 55-й и 60-й час ферментации добавляют гидроокись аммония, поддерживая рН культуры 4,5.На 6-й день культивации содержание сухо го материала в бульоне 3,42/о, общее содержание алкалоида 1246 у/мл, в то время как содержание эргокорнина - эргокриптина достигает 646 у/мл. Содержание эргометрина 202 //мл.15 Бульон обрабатывается далее по методике, описанной в примере 1. 20 Способ получения алкалоидов спорыньипутем выращивания культуры С 1 ачсерз рцгрцгеа в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей источники . углерода, азота и минеральные,соли, с последую щим выделением целевого продукта, отлич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода препарата, используют штамм Сал.серв рцг 1)цгеа ОК 1 88/1972,30 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Великобритании1170600, кл.С 26, опублик. 1968,
СмотретьЗаявка
1952210, 20.07.1973
ГЕЗА ВАК, ЛАЙОШ НАДЬ, ДЕНЕШ СЕКЕЛЬ, ИОЖЕФ СОЛНОКИ, ЭВА УДВАРДЬ-НАДЬ, ЭРЖЕБЕТ ЖОКА
МПК / Метки
МПК: C12D 13/00
Метки: алкалоидов, спорыньи
Опубликовано: 15.06.1977
Код ссылки
<a href="https://patents.su/4-562205-sposob-polucheniya-alkaloidov-sporyni.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения алкалоидов спорыньи</a>
Предыдущий патент: Способ получения цеаксантина
Следующий патент: Способ отделения волосяного покрова от кожевой ткани, шкуры
Случайный патент: Устройство для штамповки деталей