Способ получения цеаксантина

% ф и стет 1эийдктзтткй МЫЛ 11 1 562204 ОП ИСАН И ЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик4 (21) 20484/15 (32) 2 б.07.73 (33) Швейпарн 2) Заявлено3) Приоритет1) 10904/73 Государственный комитет Совета йЮинистрав СССР оо делам изобретенийпъблпковано 15,06.77. Бюллетень ЪЪ 22 открытий ния описания 28,09.7 ата опублико 72) Авторы изобретения Иностранцы Давид Шеферд, Ярослав Дасек, Мариет Сюзанн К(Швейцария) Иностранная фирма Сосьете де Продюи Нестле С.А.атерин Карел 71) Заявител 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕАКСАНТИНА Изобретение относится к способу получения цеаксантина микробиологическим путем.Желтый пигмент, называемый цеаксантином или 3,3-диокси-р-каротином, может быть использован в качестве кормовой добавки для кур с целью усиления желтой окраски их кожи или хкелтка яиц, Изучается возможность использования этого вещества в качестве красителя в косметической и пищевой промышленности, 1 ОИзвестен способ получения цеаксантина, включающий культивирование продуцентов сго микроорганизмов рода 1,"1 а оЬас 1 ег на жидкой питатсльной среде, содержащей источники усвояемого углерода, свободные ами нокислоты, минеральные соли, микроэлементы и витамины 11.Однако промышленное получение этих пигментов путем биосинтсза является очень сложным и часто характеризуется низким вы О ходом цеаксантина со значительным ,расходом количества культуральной среды, необходимой для получения больших количеств пигмента. Для увеличения выхода цеаксантина без существенного увеличения затрат на 25 его производство по предлагаемому способу в питательную среду, содержащую источники усвояемого углерода, свободные аминокислоты, минеральные соли, микроэлементы и витамины, дополнитсльно добавляют 0,1 - ЗО 1 мг/мл среды ппрндоксина (витампн Вб) и микроэлементы в впдс попов двухвалснтных металлов Ге, Со, Мо, Мп в концентрации, равной 0,001 в ,1 М, при этом дополнительно перед культивированием микроорганизмов в питательную среду вводят 100 - 200 к 1,мл среды серусодеркащ 11 х аминокислот, например метионин, цистсин, цистин. Выход цсаксантина превышает выход прп использовании известных классическпх способов до 200%.Увеличение выхода цеаксантина приводит, естественно, к значительному снижению издсржек его производства.Для осуществления предлагаемого способа В качестве источника ассимилируемого углерода используют 0,1 - 15% от веса культу- ральной среды глюкозы или сахарозы, и в качестве ассимилирующего аминного азота - 0,1 - 8% от веса среды дрожжевого ияли кукурузного экстракта и или гидролизата белков. В среду вводят также 0,1 - 2 все. % сульфата ъ 1 агния. 11 рнготовленную смесь веществ доводят водопроводной водой до 100 вес. %.Для модификации в среду добавляют 0,1 - 1 мкг,мл, предпочтительно 0,1 - 0,3 мкг/мл пиридоксина.В приготовленный таким образом питательный раствор добавляют пнокулюм мнкроорганизмов из рода 11 м оЬас 1 ег, явлшощих. ся родуцеами цеаксаа, ерметацию осуществляют при постоянном перемешивании и аэрации при определенных значениях рН и температуре в течение времени, необходимого для получения значительного количества внутриклеточного цеаксантина, В случае,необходимости после концентрирования питательной среды, клеточный цеаксантин экстрагируют таким полярным органическим растворителем, как ацетон, этиловый спирт или хлороформ. Виомассу отделяют от культуральной среды путем центрифугирования, декантации или фильтрацш, и заем ее можно использовать или в качестве кормовой добавки для кур, или,для получения экстракта в полярном органическом растворителе.Таким образом, количества цеаксантина в биомассе постоянно увеличиваются до 10%, количество биомассы увеличиваетсядо -20% и продуцирование цеаксантина по предлагаемому способу возрастает примерно на 30% по сравнению с классическим способом.Подобное стимулирование продуцирования цеаксантина микроорганизмами из рода 11 ачоЬас 1 ег происходит при добавлении в основной питательный раствор или ионов двухвалентных металлов Ее+, Со, Мо, Мп, или серусодержащих аминокислот метионина, цистина и цистеина или смеси ионов металлов с серусодержащими аминокислотами, Продуцирование цеаксантина возрастает до 1 о 0% по сравнению с выходом при выращивании культуры такого же микроорганизма на классической питательной среде,Согласно предлагаемому способу состав среды изменяют добавлением ограниченных количеств ионов металлов Ее, Со, Мп, Мо, причем во избежание проявления ингибировапия концентрация вводимых в среду ионов Ге+ и/или о и/или Мпф+ и/или Мо не должна превышать 0,2 Л, Оптимальные концентрации 0,0005 - 0,1 /4 и наиболее предпо елшые 0,001 - 0,05 М. Ионы металлов можно вводить в виде таких хорошо растворимых солей, как сульфат железа или хлористое железо, хлористый кобальт, молибдат натрия, сульфат магния,По предлагаемому способу состав среды изменяют также добавлением ограниченных количеств серусодержащих аминокислот, например метионина, цистина и цистеина или их смесей, причем их количества во избежание проявления ингибирования, не должны превышать 1 мкг/мл, Наиболее предпочтительное количество 100 - 200 мкг/мл. Для введения в среду предпочтительным ионом металла является Ее+, а предпочтительной аминокислотой - метионин.Когда в среду добавляют указанные стимуляторы стимуляция продуцирования микроорганизмов из рода Е 1 ачоОасе заъетно увеличивается. Оба эффекта стимуляции усиливаются и проявляются в увеличении продукции цеаксантина примерно до 200% по 20 25 3 д 35 40 45 50 55 Д 65 сравнению с выходом, получаемым при выращивании культуры этого микроорганизмана классической питательной среде, Приростпродукции, получаемый вследствие увеличения концентрации цеаксантина в биомассе,превышает прирост вследствие увеличениятолько биомассы, который бывает не более10%,П р и м е р 1. Готовят культуральную среду,состава, вес. %:Глюкоза 3Гидролизат казеина(триптон) 1Дрожжевой экстракт 1Сульфат магния 0,5Вода водопроводная До 100. Эту среду помещают во флаконы, стерилизуют при 120 С в течение 20 мин, затем охлаждают до 25 С, р 11 среды после стерилизации устанавливают 7,3. Вводят в среду инокулюм мутанта штамма Л 1 СС Л 21588 из рода НачоЬасег. Культуру этого микроорганизма выдерживают на среде в течение 48 ч при температуре 25 С, постоянно аэрируя ее при вращении флаконов на специальных аппаратах со скоростью 200 об/мин. Затем флаконы центрифугируют и получают 10,3 г целевого продукта на 1 л питательной среды.Количество цеаксантина, содержащегося в клетках, определяют экстракцией пигмента и последующим измерением оптической плотности экстракта. Для получения экстракта приготовляют суспензию клеток 0,5 мл водного солевого раствора, затем добавляют равный объем ацетона, встряхивают несколько минут и фильтруют. Оптическую плотность фильтрата определяют на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Количество цеаксантин: определяют, сравнивая полученную оптиче скую плотность со стандартной кривой, полученной измерением оптической плотности нескольких разведений, содержащих различные количества чистого цеаксантина,Такой способ экстракции и измерения применяют для большого количества образцов подобной ку льту ры. Выводят среднее арифметическое полученных численных результатов, Количество цеаксантина, содержащегося в клетках, или специфическую концентрацию, также определяют, исходя из 5,1 мг на 1 г клеточной массы, это составляет продукцию цеаксантина в количестве б 2,4 мг на 1 мл питательной среды. 1 очность этой оценки составляет около -1- 3 - 5%,В таблице приведено несколько примеров влияния вида добавляемых веществ на выход цеоксантина, Количества указаны в мкг пиридоксина и/или соответствующей аминокислоты на 1 л среды и в молярной концентрации соответствующих ионов в мг на 1 мл питательной среды. Понятие клеточная масса означает количество цеаксантина, содержащегося в полученных клетках в мг цеаксантина на 1 г целевого продукта.Количество Добавка миг/мл 1 2 3 5 62,4 83,8 109,6 130,4 97,6 10,3 12,7 13,4 11,6 7,2 6,1 6,6 8,2 11,2 13,5 Никакой 0,2 0,01 0,01 0,01 0,2 0,2 120 154,7 6,9 120 187,4 16,4 11,4 0,2120 0,01 11,2 126 11,3 0,520 0,01 178,5 11,3 0,01 15,8 0,21200,21200,2120 1 О 10,9 16,1 175,8 183,7 0,01 11,2 0,01 Источник информации,принятый во внимание при экспертизе1, Патент франции2099367, кл. С 12 Р1. Способ получения цеаксантина, включа 5/00, 1972.ющий культивирование продуцентов его микСоставитель Л. МураяТехрсд 3, Таранеико Редактор И. Селищева Корректор Л. Денискина ввкпп 1691,8 11 ва 554 Тираж 563 11 ПО Государственного комитета Совета Министров СССР по дслвм изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская иаб., д. 4/5Подписное Типогрвфия, пр. Сапунова, 2 Пир идок сииГе +Пиридсксин, Ге+ПиридоксинМетиоиииГеМетиоиииП и ридо к с ии, Ге "+МетиоиишГ 1 иридоксии, Ге +МетиоиинПиридоксин ГеМетионииПиридоксии, ГеМетионинПиридоксии, Ге+Метиоиии Добавление пиридоксина в среду производят после ее стерилизации, Ионы двухвалентных металлов и/или соответствующих аминокислот добавляют в среду непосредственно перед введением в нее инокулюма или перед стерилизацией среды. Выход клеточной массы и цеаксактина определяют с точностью около -1-3 - 5%, Он представляет собой среднее арифметическое значений, определенных для трех из десяти образцов данной культуры.В последних примерах несколько изменен состав основной среды и природы инокулюма с тем, чтобы подтвердить, что успех скосооа зависит не от определенного состава среды илн одного удачно подобранного мутанта. Так, например, в примере 9 основная среда содержит 2% дрожжевого экстракта и 1% триптана, в примере 10 - 1% дрожжевого экстракта и 2% триптака и в примере 11 использован мутант не такой, как в других примерах,роорганизмов из рода ГаоЬас(ег,на жидкой питательной среде, содержащей источники усвояемого углерода, свободные аминокислоты, минеральные соли, микроэлементы и витами ны, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода цеаксантина, в питательную среду перед культивированием микроорганизмов добавляют пнрндоксин (витамин Вв) в количестве до 0,1 - 1 мг/мл среды и микро элементы в виде ионов двухвалентных металлов Гс, Со, 1 о, Мп + в концентрации, равной 0,001 - 0,1 М. 2. Способ о и. 1, отличающийся тем, 15 что в питательную среду перед культивированием микроорганизмов дополнительно вводят серусодержащие аминокислоты, например метионин, цистеин, цистин в количестве 100 - 200 мкг/мл среды.20