Способ получения сиродесминов,

ч,ерс 1 Фифам еФЬА ОПИСАН И ЕР 155290 б Саюз Советских Социалистических Республик(51) М. Кл.С 12 Р 9 асударственный комитет авета Министров СССР оа делам изобретений Опубликовано 30,03.77. Бюлл Дата опуоликования описани ень124.06.7 615,779.932(72) Авторы изобретения Иностранцы Гарольд Джордж ХемДуглас бродбент инг и барри Хесн 171) Заявитель Имнер имитед(54) СПОСОБ ПОЛУ бласти микробиолучения новог с несущими споры клетками, возникающипри росте на агаре или на воздухе.Споры, образующиеся из неспециализированных ветвей конидиофоры видны в длинных, 5 редко разветвленных цепях. Они представляют собой амероспоры и дидимоспоры, развивающиеся от вершины к основанию.Зрелые споры имеют грубые коричневожелтые клеточные стенки, обычно довольно 10 толстые, но местами тонкие. Амероспоры шарообразные, дидимоспоры почти цилиндрические с сужением около перегородки.Источником усвояемого углерода являются,например, многоатомные спирты - сахароза, 15 глюкоза, лактоза, глицерин или маннит; источник полимеризуемого углерода, например, крахмал, природные или синтетические масла .или жиры, или смеси двух или более веществ.Источник углерода содержится в среде в 20 количестве от 0,1 до 30% по весу, предпочтительно в пределах от 2 до 8% по весу.Источником усвоя ем ого азота являютсявещества органического или неорганического происхождения. Они могут быть в форме нит рата щелочного или щелочноземельного металла или аммонийной соли неорганической или органической кислоты, например, нитрата натрия, калия, кальция или аммония, тартрата аммония, сульфата аммония или фосфата та ми Изобретение относится к оологии, а именно к способу п о антивирусного комплекса.Описания способа получения препаратов с использованием культуры Ягог 1 езтп 1 цтп Йчегзцгп в доступной специальной и патентной литературе не обнаружено.Способ получения сиродесминов А, 6,1 заключается в том, что штамм Ягодезгп 1 цгп Й-, негзцгп С,М,1. 102519 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, экстрагируют фильтрат культуральной жидкости органическим растворителем, несмешивающимся с водой, выпаривают экстракт досуха, обрабатывают двуокисью серы в органическом основании и разделяют комплекс при необходимости на компоненты.Подходящим штаммом для получения сиродесминов является штамм Ягос 1 езгп 1 цгп йчегзцтп, полученный в Государственном микологическом институте, находящемся в Ферри Лейн, Кью, Англия за номером С.М.1. 102519.Культура хорошо произрастает на обычной агаровой среде, и через 6 дней в колонии образуется центральный участок спорообразующего мицелия, окруженный зоной гиф, которая может быть как воздушной, так и погруженной. Эта зона неокрашена. Спорообразующая область обычно темно-коричневого цвеИРОДЕСМИНОВ А, б, 1аммония, Они могут быть и в форме аминокислоты, например, глицина, в форме муки из семян хлопчатника или жидкости моченой кукурузы, пептона, мочевины, дрожжевого экстракта или мясного экстракта. Можно использовать смеси двух или более указанных веществ.Источник азота содержится в среде в количестве от 0;001 до 1,0 ю/ю.В среде могут быть такие элементы, как фосфор, в виде первичного кислого фосфата калия или вторичного кислого фосфата аммония, магний в виде сульфата или карбоната магния, сера в виде сульфата и калий в виде хлорида или карбоната калия и микроэлементы - железо, марганец, цинк, молибден и медь.Б качестве водной питательной среды используют среду Чапек-Докс.Культивирование организма осуществляют при температуре от 15 до 35 С, предпочтительно при температуре 25 С,В качестве несмешивающегося с водой органического растворителя используют хлороформ, этилацетат, толуол или диэтиловый эфир,Антивирусный комплекс включает восемь соединений, обладающих способностью задерживать рост вирусов и идентифицированных как сиродесмины А, В, С, Д, Е, Г, 6 и Н. При обработке комплекса, задер;кивающего рост вирусов, двуокисью серы образуетсясоединение, обладающее тем же свойством,что и сиродесмин 1,Сиродесмины Л, б, 1 имеют следующиехарактеристики.Сиродесмин Л, Молекулярная формулаСгюН 28 К 20852.Найдено, %: С 49,7; Н 5,4; Х 5,8; 5 12,8,Вычислено, /ю. С 49,7; Н 5,4; И 5,8; 5 13,2.Масс-спектр. Отсутствует исходный ион, ноимеется сильный пик при (М - 52) - . Найдено(бензол, 60 С, 3 час) образуется бис-триметилсилилпроизводное.В масс-спектре этого производного отсутствует исходный ион, но виден слабый пик, соответствующий (М - СН,) - при т/е 615,(+)1689; С 28 Н 89 Х 20852812 требует т/е 615, 1686.Лцетилировачие. При обработке сиродесмина А уксусным ангидридом в пиридине в течение недели при температуре 22 С получается бисацетат с температурой плавления 186 -189 С.Найдено, /ю: С 50,5; Н 5,3; Х 4,9.С 24 Н 89 М 201982 требует С 50,7; Н 5,2, К 4,99/ю.Наибольший пик масс-спектра (М - 52) -(+)при т/е 506, 1871; С 24 НзюК 201 ю требует т/е506, 1901,При обработке сиродесмина А уксусным ангидридом в течение одного часа при температуре 22 С получается моноацетат.Найдено, %: С 49,9; Н 5,3; М 5,3; 8 11,7.С 22 Н 28 Х 20952 требует С 50,0, Н 5,2, К 5,2,5 8 12 ю/юНа масс-спектре виден небольшой пик для(М - 8)при т/е 496 и сильный пик для(+)10 При гидролизе сиродесмина А 0,1 н. раствором НС 1 в метаноле получается дезацетилсиродесмин А с температурой плавления198 в 2 С.Найдено, % . С 48,4; Н 5,6; К 6,0; Ь 14,3.С,2 Н 24 К 20,52 требует С 48,8, Н 5,6, Х 6,3,8 14,4/ю.В масс-спектре отсутствует ион, но виденсильный пик для (М - 52) - при т/е 380.(:-)При обработке сиродесмина Л трифенилфосфином в хлороформе получается моносульфид.Найдено, /ю: С 52,7; Н 5,7; И 5,8; 5 7,1.СгюН 281 Ч 2088 требует С 52,9, Н 5,8, М 6,2,25 Ь 70%.Молекулярный ион виден при т/е 454.Сиродесмин б, Молекулярная формулаСгюнг 6 И 20882.Найдено, %: С 49,7; Н 5,4; К 5,7; Ь 12,6.З 0 Вычислено, ю/ю. С 49,4; Н 5,4; М 5,8; Ь 13,2.Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, новиден сильный пик для (М - 82) - при т/еС)422,Гидролиз. При обработке сиродесмина 60,1 н. раствором НС 1 в метаноле образуетсядезацетилсиродесмин б, т. плавления 195 -196,5 С.Найдено, %: С 48,4; Н 5,5; М 6,5; Я 14,6.Вычислено (ю/ю) для С 18 Н 24 К 20752: С 48,8;Н 5,5; К 6,3; Я 14,4.Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, новиден сильный пик для (М - Ьг) - при т/е380.45 Ацетилирование, При обработке сиродесмина 6 уксусным ангидридом в пиридине в течение 9 дней при окружающей температуреобразуется бисацетат сиродесмина б с температурой плавления 159 в 1,5 С.50 Сиродесмин 1. Молекулярная формулаС 291 2 Р 2 О 882Найдено, %; С 498; Н 55; М 55.Вычислено, ю/ю. С 49,4; Н 5,4; Х 5,8.Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но55 . (+)виден сильный пик для (М - 52) - при т/е422 и слабый пик для (М - 8) - при т/е 454.(+)Сиродесмина А 1, б, 1 разделяют методомхроматографии в тонком слое на силикагеле,б 0После проявления пластины опрыскиваютраствором хромовой кислоты и нагревают;вначале появляются желтые пятна, а затемчерные. При применении трех разных растб 5 ворителей получают следующие величины Ру.5Сиродесмин А; 0,23 (толуол - этилацетат, 1: 2), 0,35 (хлороформ - метанол - муравьиная кислота, 95; 4: 1), 0,19 (хлороформ - этилацетат, 1:1);сиродесмин 6: 0,38 (толуол - этилацетат, 1: 2), 0,39 (хлороформ - метанол - муравьиная кислота, 95: 4: 1), 0,32 (хлороформ - этилацетат, 1:1);сиродесмин 1: 0,38 (толуол - этилацетат, 1: 2), 0,35 (хлороформ - метанол - муравьиная кислота, 95: 4: 1), 0,28 (хлороформ - этилацетат, 1;2),Сиродесмины легче всего идентифицировать при исследовании их спектров ядерного магнитного резонанса.Инфракрасные спектры сиродесминов очень похожи один на другой.Комплекс, получаемый при экстракции грибкового бульона, и выделяемые из него новые соединения - сиродесмины А, В, С, Д, Е, Р, б, 1, дезацетилпроизводные сиродесминов А и 6, моноацетат сиродесмина А и моносульфид сиродесмина все обладают способностью задерживать рост вирусов в присутствии клеток хозяина и обладают активностью в отношении риновирусов в присутствии эмбриональных легочных клеток человека, а также в отношении вирусов Кокссаки А и В и Эко-вирусов.Активность в отношении риновирусов измеряют следующим образом. Легочные эмбриональные клетки человека выращивают обычным способом на минимальной специфической среде. Игла с добавлением 1% телячьей сыворотки в стеклянных трубках при температуре 33 С. Восемь групп (по три в каждой из таких трубок) обрабатывают испытуемыми растворами соединений в той же среде, содержащей (мг): 200, 50, 12,5, 3,1, 0,8, 0,2, 0,05 и 0,00 испытуемого соединения в 1 мл раствора.Инкубацию проводят при 33 С, и через 24 час в каждую трубку помещают дозу риновируса, например риновируса типа 2, соответствующую 100-кратной дозе культуры, вызывающей 50% инфекции.После дополнительной инкубации в течение 2 дней при 33 С каждую трубку исследуют визуально для определения наличия цитопатического эффекта, вызываемого токсичностью соединения, Активной дозой испытуемого соединения называется концентрация соединения, которая защищает 50% клеток от цитопатического эффекта, вызываемого ростом вируса. Токсичной дозой называют концентрацию испытуемого соединения, которая обусловливает токсичность соединения у 50% клеток культур, обработанных при такой концентрации соединения,Комплекс и соединения задерживают рост риновируса типа 2 при концентрации равной или менее 0,25 мг/мл, но в то же время не оказывают заменого токсического эффекта на клетки ткани культуры при дозах, по край ней мере, в 10 раз больших наименьшей активной дозы.При применении с целью достижения антивирусного эффекта в присутствии клеток хо 5 зяина комплекс или соединение дают хозяину при концентрации близкой к концентрациивируса - от 0,003 до 0,25 мг/мл. Применяютего через нос или горло при дозах от 0,02 до0,1 мг 3 - б раз в день. Для взрослых людей10 это эквивалентно дневной дозе от 2 до 20 мг.Комплекс или его компоненты используюткак фармацевтический препарат в форме таблеток, лепешек, капсул, носовых капель, жидкосгей для впрыскивания в нос или горло,15 аэрозолей или жидкостей для ингаляции. Ихможно приготовлять обычными способами сдобавкой обычных индифферентных компонентов.К предпочтительным композициям для не 20 посредственного введения (например, в форме лепешки, которая медленно растворяетсяво ртусмачивая его и связанные с ним дыхательные пути раствором активного ингредиента) относятся композиции для ингаляции25 носа или горла в виде растворов антивирусного комплекса или соединения в фармацевтически допустимой жидкости, которая при ингаляции отлагается в носовых проходах и горле, а также композиции для приема внутрь,ЗЭ например, таблетки,55 0,0150,00 60 1,00 Таблетки или лепешки содержат от 0,05 до5 мг антивирусного соединения. Для профилактики или лечения вирусной инфекции та кие таблетки принимают от 3 до б раз в день.Состав для впрыскивания в нос или горлосодержит от 0,01 до 1 мг антивирусного соединения в 1 мл раствора, и для профилактики или лечения риновирусной инфекции при мерно 0,1 мл такого раствора впрыскивают внос или горло 3 - б раз в день.Композиции могут содержать и другие известные фарм ацевтически полезные соединения, например, вещества, уменьшающие за стой в носу, жаропонижающие средства иантисептики.Комплекс, соединения или композиции можно применять профилактически всем людямили тем, которые соприкасаются с носителя ми риновирусной инфекции.П р и м е р 1. Питательную среду готовятиз следующих компонентов: (вес. ч):Нитрат натрия 2,00Первичный кислыйфосфат калия 1,00Семиводный сульфатмагния 0,50Хлорид калия 0,50Семиводныи сульфатжелезаДекстроза (церелоза)Дрожкевой экстракт5 Й 996 . с дуктом, фракция 5 содержит сиродесмины Л,В и С совместно с нежелательным продуктом,Фракция 6 содержит сиродесмин В совместнос основным продуктом.5 Фракции 4 - 6 дополнительно разделяютметодом хроматографии в тоцком слое на силикагеле С.Г. Для проявления используютследу 1 огцне смеси и растворители: 1-ый растворитель - этилацетат н толуол (2: 1),10 2-ой растворитель - муравьиная кислота, метанол и хлороформ (1: 4: 95). Разделенныепродукты выделяют при элюнровании соответствующих полос сх.есшо этилацетата и метанола (97: 3),15 Пример 3. К питательной среде, приготовленчой как описано в примере 1, добавляют гидроокись калия в виде 10 н. раствора дорН 5,6 и автоклавируют при давлении0,7 кг/см 25 мин. 51 гос 1 еяп 1 цгп с 11 чегзцгп20 С,М,1, 102519 выращивают при температуре25 С в конических колбах емкостью 500 мл,содержащих по 150 мл среды, на вращающемся устройстве. Через 4 дня 12 мл бульонаиспользуют для инокуляции дополнительного25 количества колб, содержащих такое же количество той же среды. Через 12 дней р-стаполучают культуру. Установив рН 6,0, фцльтрат (50 мл) дважды экстрагируют головинным объемом хлороформа, Объединенные30 экстракты выпаривают и получают антивирусный комплекс.П р и м е р 4, Приготавливают раствор дляпульверизации в полость носа из следующихкомпонентов (м.).35 Сиродесмин А 6Тимерозал 2Метиловый эфир параоксибензойнойкислоты 80Пропиловый эфирпараоксибензойнойкислоты 20Фосфат натрия 500Динатриевая соль ЭДТК 545 Дистиллированная вода(без пирогенов) 0;15 40 до 100 (мл) 50 Способ получения сиродесминов А, 6, 1,отличающийся тем, что штамм Йгодезпицт с 1 иегзцгп С.М.1. 102519 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, экстрагируют фильтрат 55 культуральной жидкости органическим растворителем, несмешивающимся с водой, выпаривают экстракт досуха, обрабатывают двуокисью серы в органическом основании и разделяют комплекс при необходимости на ком поненты. Подписное Заказ 903,19 Изд,326 Тираж 589 ЦНИИПИ Типография, пр, Сапунс ва, 2 Концентрат второстепенных элементов приготавливают из следующих компонентов (вес. ч):Семиводный сульфатжелеза 1,00Пятиводный сульфатмедиСемиводный сульфатпинка 1,00Четырехводный сульфатмарганца 0,10Молибдат калия 0,10Эти компоненты растворяют в дистиллированной воде с добавлением концентрированной соляной кислоты в количестве достаточном для получения прозрачного раствора и разбавляют до 1 л дистиллированной водой,К питательной среде добавляют 10 н. раствор гидроокиси калия до рН 5,8 и автоклавируют при давлении 0,7 кг/см 25 мин.Ягос 1 езгп 1 цгп дкегзцгп С.М.1. 102519 выращивают при температуре 25 С в поверхностной культуре в 90 бутылках Томпсона, каждая из которых содержит 1 л питательной среды, Продукт собирают через 35 дней, и фильтрат культуры (70 л, рН - 6,5) экстрагируют толуо,-.ом (2 раза по 14 л). Ооъединенньте экстракты высу.пивают оезводным сульфатом натрия и выпаривают при 60 С.Остаток (7,1 г) промывают петролейным эфиром (4 раза по 25 м,л), промывную воду отбрасывают и получают активпрусный комплекс.П р и м е р 2. Антивирусный комплекс, полученный в примере 1, объединяют и разделяют на 2 равные части. Каждую часть отдельно фракционируют на хроматографических колонках, которые приготавливают следующим образом, Колбу емкостью 2 л, содержашую силикагель (900 г) и воду (100 мл) вращают при комнатной температуре 2 час, затем добавляют смесь диэтилового эфира и этилацетата (3: 2; 115 мл), и колбу вращают еще 3 час, Полученный силикагель упаковывают в найлоновый лист и получают сухую колонку размером 90 Х 4 см. Через верх колонки добавляют экстракт в минимальном объеме смеси эфира и этилацетата (3:2), и колонку проявляют той же смесью растворителей до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет основания колонки. Каждую колонку разрезают на шесть равных секций, объединяют равноценные секции двух колонок и элюируют смесью этилацетата и метанола (97: 3) 3 раза по 500 мл.При выпаривании растворителей получают 6 фракций: 1-ая фракция наименее полярна, а 6-ая - наиболее полярна. Фракции 1 - 3 отбрасывают, фракция 4 содержит сиродесмины А и С совместно с менее полярным проФормула изобретения