Способ получения антибиотиков

(31) 461298 (33) СШАОпубликовано 30,03.77. осударствениыи комитетСовета Мииистров СССРоо делам иэооретеиийи открытий юллетень12ы ьтер Патрик Каллеи Раутии ал Моппетт ия) юнсюке То(71) Заявите Иностранная фирма Пфайзер ИНК(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ 1Изобретение относится к способам получения антибиотиков, в особенности синергической смеси антибиотиков, образуемой при культивировании микроорганизмов-продуцентов их.Известны способы получения различных антибиотиков путем культивирования определенных микроорганизмов-продуцентов, например, вида Ас 11 пор 1 апез зр. 1 ЧКК 1. 3884 1,Антибиотики, получаемые по известному способу, обладают, в, частности, способностью ускорять рост животных и антимикробной активностью против ряда патогенных микроорганизмов.Предлагаемый способ получения антибиотиков в литературе не описан. Согласно ему при производстве антибиотиков используют культуру штамма Ас 11 пор 1 апез ацгап 6 со 1 ог АТСС 31011, которую выращивают в жидкой питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода и азота, в аэробных условиях до достижения значительной антибиотической активности с последующим выделением из среды выращивания смеси антибиотиков или отдельных ее соединений.Смесь антибиотиков содержит макроциклические лактоны и депсипептиды и может быть 5 выделена и рекуперирована из ферментационного бульона с помощью экстракции растворителем, противоточного распределения, колоночной хроматографии или комбинации этихспособов.10 Индивидуальные компоненты антибиотиковобладают существенной бактерицидной активностью. Сырая смесь антибиотиков или комбинация чистого макроциклического лактона и чистого депсипептида, полученного из сырой 15 смеси, показывает значительную синергетическую бактерицидную активность. Сырая смесь антибиотиков, чистые индивидуальные компоненты и смеси чистых макроциклических лактонов и депсипептидов являются эф фективными агентами стимулирования ростацыплят и свиней, а также активными терапевтическими средствами для лечения дизентерии у свиней,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Микроорганизм, используемый для получения антибиотика согласно данному изобретению, выделен из образца почвы в Египте.Для выращивания применяли картофельноморковный агар-агар и установили, что онпринадлежит к классу актиномицетов, дающих спорангий, подобный спорангию видаАс 11 порапез, Поэтому для роста его применяли различные среды, использующиеся привыращивании этих видов. Суспензии культуры готовили путем дробления кусков культуры, снятой с пластинок с агар-агаром, и вели выращивание в небольших пробирках сдобавлением стерильной дистиллированной воды и доведением объема культуры до 5 мл.Затем эти суспензии выращивали в пробирках, на пластинках или в чашках Петри наразличных средах. Температура инкубации составляла 28 С. Результаты оценивались через14 - 22 дней, Эта новая культура (ПфизерГ.Р, 24090) была доставлена в АмериканскуюКоллекцию типов культур в Роквилле, Мэриленд, 11 марта 1974 г, и получила названиеЛсЫпор 1 апез ацгап 11 соог АТСС 31011.Использовали следующие среды для идентификации кульгуры:1) 2-ный агар-агар на водопроводнойводе;2) картофельно-морковный агар-агар поМ. П. Лешевалье (1968 г.);3) сахарозный агар-агар Чапека по Уоксмен (1961 г.);4) глюкозно-аспарагиновый агар-агар поУоксмен (1961 г.);5) агар-агар с экстрактом дрожжей и солодом;6) агар-агар Хики и Треснера;7) картофельно-глюкозный агар-агар;8) крахмальный агар-агар;9) желатина;10) тирозиновый агар-агар;11) железо-пептоновый агар-агар Дифко;12) снятое молоко Дифко;13) декстрозно-нитратный бульон;14) бульон на основе органического соединения и нитрата;15) среда АТСС 172, американский Каталогтипов культур;16) с применением углерода.Признаки, характеризующие данную культуру,Рост на среде, содержащей агар-агар на водопроводной воде, слабый, колонии тонкие,плоские, примерно 9 Р 2 (очень слабо-розовые); воздушный мицелий отсутствует, субстрат мицелия от бесцветного до 9 Р 2, растворимый пигмент отсутствует.Сахарозный агар-агар Чапека. Рост от умеренного до хорошего, колонии плоские, примерно 966 (светло-оранжевые); воздушныймицелий отсутствует; субстрат мицелия около966; растворимый пигмент отсутствует,Глюкозно-аспарагиновый агар-агар, Ростумеренный, колонии возвышающиеся, шероховатые, примерно 969 (светло-оранжевые); воздушный мицелий отсутствует, растворимый пигмеи.г отсутствует.Агар-агар с экстрактом дрожжей и солодом. Рост не наблюдается.Агар-агар Хики и Треснера. Рост от умеренного до хорошего, колонии слегка возвышающиеся и шероховатые, примерно 9 Г 9 (мутно-оранжевые), слабый беловатый налет на поверхности, субстрат мицелия примерно 918, бледно-коричневый растворимый пигмент.Картофельно-глюкозный агар-агар, Рост умеренный, колонии возвышающиеся, шероховатые, примерно 91.9 (светло-оранжевые), воздушный мицелий отсутствует, субстрат мицелия примерно 91.9, растворимый пигмент отсутствует.Тирозиновый агар-агар. Рост от слабого до умеренного, колонии плоские, примерно 13 А 10 (мутный красновато-оранкевый цвет) воздушный мицелий отсутствует, субстрат мицелия примерно 10 Р 11, коричневый растворимый пигмент.Желатина, Рост умеренный, колонии плоские, примерно 9 К 12 (красновато-оранжевые); следы беловатого налета, субстрат мицелия примерно 9 К 12, растворимый пигмент отсутствует.Крахмальный агар-агар. Рост от умеренного до хорошего, колонии возвышающиеся, примерно 9 К 10 (оранжевые), слабый беловатый налет, субстрат мицелия примерно 9 К 10, светло-желтый растворимый пигмент,Крахмал подвергается слабому гидролизу, степень окижения желатины высокая, нитраты не восстанавливаются до нитритов в любой среде, содеркащей нитраты, даже за 22 дня (рост очень слабый в декстрозно-нитратном бульоне, но хороший в бульоне, содеркащем органические вещества и нитрат),Образование сероводорода незначительное. В железо-пептоновом агар-агаре образование растворимого пигмента не наблюдается. В молоке не наблюдается каогуляции или гидро- лиза даже по истечении 22 дней. Тирозин не дегидрируется.Рост в среде АТСС 172 наблюдается при температуре от 21 до 37 С, наилучший рост при температуре от 28 до 37 С, при температуре 45 С роста не наблюдается.Арабиноза, фруктоза, маннит, раффиноза, рамноза, сахароза и ксилоза потребляются, инозит не потребляется. Ни на какой из сред не наблюдаетсязапаха.Спорангий образовывается лишь на картофельно-морковном агар-агаре. При этом образовывается палисадный слой, 5,5 - 11 Х 4,5 - 8 мкм по ширине и 9 - 12 мкм по высоте. Колонии многочисленны, неправильные по форме и выбрасывают споры при постепенном размягчении, Спорангий на картофельно-морковном агар-агаре по прошествии трех недель инкубации выделяет споры за несколько часов при температуре около 21 С, если куски колоний погружают в небольшое количествораствора: 1 г глюкозы и 1 мл Твина 80 в 1 л воды.Споры образовывают цепочки неправильной формы в спорангии, но будучи освобожденными от спорангия, становятся субглобозными и имеют ширину от 1,6 мкм доэллиптической формы 1,6 - 2,2 Х 1,1 - 1,6 мкм. Почти все они подвижны.Культивирование А. ацгап 11 со 1 ог АТСС 31011 предпочтительно происходит в водной питательной среде при 26 - 36 С в погруженном аэробном состоянии при перемешивании,К числу питательных сред, пригодных для его выращивания относятся те, которые включают источник усвояемого углерода, такие как сахара, крахмал и меласса; источники органически связанного азота, такие, как казеин, продукт энзиматического расщепления казеина, соевая мука, мука из семян хлопчатника, мука из арахиса и глютен пшеницы, Источниками роста могут также являться отходы винокуренных заводов, рыбная мука и экстракт дрожжей, а также соли, такие, как хлористый натрий и карбонат кальция, и микроэлементы, например, железо, магний, цинк, кобальт и марганец. При чрезмерном пенообразовании во время культивирования можно вводить в питательную среду антивспениватель, например растительные масла или силиконы.Аэрация среды в резервуарах при выращивании культуры глубинным способом проводится предпочтительно со скоростью около 1,2 - 2,0 объема свободного воздуха на 1 объем бульона в минуту, Скорость перемешивания поддерживается при помощи мешалок, обычно употребляемых в бродильной промышленности.Агент инокулирования для приготовления антибиотиков может быть получен путем использования культуры с пластинки на среде, например, АТСС 172, упоминавшейся выше.Эта культура может быть использована для инокулирования либо содержимого колб, находящихся на встряхивателе, либо содержимого в резервуарах для инокулирования, или в резервуары могут быть внесены зародыши из колб, подвергавшихся встряхива 1 нию.В колбах на встряхивателе рост культуры обычно достигает своего максимума примерно через 4 дня, в то время как при инокулировании в резервуарах наиболее благоприятен период от 2 до 3 дней. Значительная антибиотическая активность достигается на конечной стадии ферментации примерно за 20 - 30 час.Способ производства антибиотиков во время процесса ферментации обычно контролируется биологической проверкой бульона с применением чувствительного штамма ЯарЬу 1 ососсив ацгецз. При этом используется стандартный метод испытаний на пластинке, при котором зона инги бирования, окружающая кружок фильтровальной бумаги, насыщенной бульоном, принимается за меру антибиотической активности, После того, как антибиотическая активность сораживаемого бульона достигла желательного уровня, продукты выделяют либо из всего бульона, либо из профильтрованного бульона. В последнем случае5 мицелий удаляют фильтрованием или центрифугированием. Можно использовать также метод тонкослойной хроматографии на силикагеле. Этот метод служит для анализа смесиантибиотиков, полученных в ферментационной10 среде, и дает возможность установить составсырых и очищенных материалов, выделенныхэкстракцией из сбраживавшихся бульонов.Разделение компонентов смеси антибиотиков зависит от содержания антибиотиков в15 системе. Слишком малая бактерицидная активность не дает возможности обнаружить текомпоненты антибиотика, которые присутствуют в малых количествах; слишком высокаябактерицидная активность приводит к эффек 20 ту сопротивления с вытекающим из этого неудовлетворительным разделением,Система проявителей при тонкослойнойхроматографии представляет собой смесь хлороформа с этанолом (9: 1). Тонкослойные25 хроматограммы после проявления могут просматриваться в ультрафиолетовом свете придлице волны 254 ммк и 366 ммк. Биоавтографическое обнаружение бактерицидных компонентов может быть осуществлено путем налоЗО жения тонкослойной хроматограммы на агарагар с питательными веществами, в которыйвнесены зародыши чувствительного штамма5 Х, ацгепз или другого чувствительного организма.З 5 К числу главных компонентов смеси антибиотиков, выделяемой А, ацгап 11 со 1 ог АТСС31011, относится ряд макроциклических лактонов и депсипептидных антибиотических компонентов. Появление или непоявление или40 процентный состав смеси этих антибиотиковменяется от ферментации к ферментации иявляется функцией воемени, величины рН, состава среды и т. д. При соблюдении условий,приведенных в помещаемых ниже примерах,45 главными бактерицидными компонентами смеси антибиотиков являютгя соединения37 277 (депсипептпд) и39 926 (макроциклический лактон), в то время как к числуантибиотических компонентов, присутствую 50 щих в незначительном количестве, относятсясоединения37 932 (депсипептид) и35 763 (макроциклический лактон),Компоненты смеси антибиотиков могутбыть разделены и выделены из ферментапион 55 ного бульона при применении самых различных способов, включающих экстракцию растворителем, противоточное распределение поКрэгу, колоночную хроматографию или комбинацию этих способов. Прп экстракции анти 60 биотиков из бульона можно использовать различные органические растворители, такие каклороформэтплацетат и метилизобутилкетон.Экстракцию растворителем предпочтительнопроводят путем двукратной экстракции бульо 65 на при величине рН 7 при помощи объема растворителя равного - 1/3 - 1/2 объема бульона, из которого желательно выделить смесь антибиотиков.Наиболее рекомендуемый метод выделения и рекуперации компонентов смеси антибиотиков заключается в следующем. В неосветленном или осветленном бульоне доводят рН до величины около 7 и экстрагируют его двумя порциями метилизобутилкетона, объем которых составляет примерно 1/3 до 1/2 объема экстрагируемого бульона.Экстракг в растворителе концентрируют в вакууме, и концентрат обезжиривают путем экстракции его гептаном или петролейным эфиром. После этого обезжиренный экстракт в растворителе вьпаоивают досуха в вакууме. Твердые вещества подвергают противоточному распределению по Крзгу (6 тапелок) с использованием толуола (5 частей), этанола (2 части) водного Фосфатного буферного раствора с рН 4,5 (3 части) . Разделившиеся слои образуют верхнюю и нижнюю фазы системы поотивоточного распределения. После распределения слои анализируют методом тонкослойной хроматоградии. Разделенные фракции выпапивают досуха в вакууме.Твердые вещества, содержащие депсипептиды, растворяют в хлороформе, обрабатывают активированным древе-",ым ттлем, фильтгуют и выпаривают в вакуме. Остаток, полученный после выпаривания хлорофоома, растворяют в ацетоне. Твердые вещества, осадившиеся при прибавлении гептана, растворяют в небольшом количестве хлоооформа и вносят в колонку силикагеля, забуференного до пН 6, изготовленную в присутствии хлопоАопма и н.-пропанола в соотношении 99:1. Колонкч проявляют той ке системой паствопителей под давлением 5600 Н/м. Отдельные учатки колонки контролиоуют методом тонкослойной хроматографии. Фоакции, содеркащие разделенные депсипептиды, объединяют. выпаоивают в вакууме, и содержимое их кристаллизчют из апетона - гептана.Фракиии, полученные противоточным методом, содеожашие макроциклические лактоны, объединяют, выпаоивают в вакъме. и твпдые вещества растворяют в этилачетате. Раствор перемешивают с силикагелем. дилто- ют, и растворитель удаляют в ваклгме. Остаток растворяют в этиапетате и производят осаждение гежсаном. Твеодые вещества растворяют в небольшом количестве хлооодопмя и хроматограсЬируют под давлением 5600 Нм на колонке силикагеля, забуференной до рН 6,0 и изготовленной в присутствии этилапетата. Для проявления пользуются системой из этилацетата, тетоагидрофурана и гексана в соотношении 80: 20: 20. Участки колонки контролирукт методом тонкослойной хроматографии. Фракции, содепжапие разделенные макропиклические лактоны, объединяют и выпаривают в вакууме. Отдельные фракции обрабатывают дополнит".льиым противоточным распределением по Крэгу и/или колоночной 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 хроматографией с использованием различных систем проявителей. Тщательное контролирование каждой стадии очистки дает возможность выделить индивидуальные макроциклические лакгоны в достаточно чистом состоянии, так что фракции в растворителе могут быть выпарены досуха с получением чистых компонентов.А. ацгап 11 со 1 ог ЛТСС 31011 образует по меньшей мере четыре депсипептида (из них главное соединение37 277 и побочное37932) и четыре макроциклических лактона, (соединение36 926 - главное,35 763 - побочное). Однако первичными компонентами являются депсипептиды.Сырые смеси антибиотиков, получаемые непосредственно из бульона, и очищенные индивидуальные компоненты обладают широким спектром антибактериальных свойств. К числу организмов, не способных к размножению в присутствии антибиотиков, относятся: Яа 1 тпопе 11 а 1 урЬаза, ЯЬ 1 ре 11 а дузеп 1 ег 1 ае, ЕзсЬег 1 сЬ 1 а со 11, КеЫе 11 а рпецгпоп 1 ае, ЯарЬу 1 ососсцз ацгецз, Ягер 1 ососсцз руодепез, Югер.1 ососсцз 1 аеса 11 з, Р 1 рососсцз рпеппоп 1 ае, Вас 111 цз зцЫ 111 з, СогупеЬасег 1 цгп д 1 рЫЬег 1 ае, С 1 оз 1 г 1 дшпч зерйспгп, Вгцсе 11 а аЬогФцз, 1 Че 1 ззег 1 а ясса, .ас 1 оЬас 111 цз ас 1 дорЬ 11 цзРайецге 11 а гпцНос 1 да.Лнтибиотики, охватываемые настоящим изобретением, как в форме сырой смеси, так и в форме очищенных индивидуальных компонентов или их смесей могут применяться при лечении различных инфекционных заболеваний у людей и у животных. Как правило, эти антибиотики вводят орально ежедневными дозами в 0,5 - 1,0 г или парэтерально дозами в 100 - 500 мг в зависимости от типа и серьезности инфекционного заболевания и особенностей больного,Они могут вводиться в отдельности или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, и для лечения можно использовать как одинарные, так и многократные дозы.Для орального введения можно применять таблетки, содержащие различные дооавки (нитрат натрия, карбонат кальция и дикальиийфосфат), а также различные агенты дезинтеграции, такие как крахмал, альгиновая кислота и некоторые комплексные силикаты, ч; есте со связующими, такими как поливинилпирролидон, сахароза, желатина и аравийская камель. Кроме того, можно вводить смазочные вещества, такие как стеарат магния, луарилсульфат натрия и тальк, которые часто создают преимущества при таблетировании. Твердые вещества сходного типа могут также применяться в качестве наполнителей в мягких и твердых желатпновых капсулах. К числу рекомендуемых материалов относятся лактозы, а также полиэтиленгликоли высокого молекулярного веса, При применении суспензий и/или эликсиров важным ингредиентом могутМикроорганизм Сырая смесь А+В)5 25,00 6,25 3,12 Таблица 2 Е.О (мгкг) при введениСоединение (М), смесь субкутанно орально 200 - 200 20036 926 36 926 +37 277 (1:1) Сырая смесь антиб:;о- тиков 210 72 - 120 150 в 2 явиться агенты подслащивания или вкусовые вещества вместе с такими разбавителями, как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин и различные комбинации этих веществ.Растворы антибиотиков в сезамовом или в арахисовом масле или в водном пропиленгликоле могут применяться при парэнтеральном введении.Индивидуальные антибиотики проявляют бактерицидную активность, которая в основном является ба ктериостатической. Однако сырые смеси антибиотиков или смеси очищенСходные результаты были получены при индивидуальных испытаниях побочного макропик . гческого лактона - соединение35 763 (А) и побочного депсипептида - соединения37 932 (В), а также при испытании различных комоинаций; А - А, В В, (А+В), (А+В), (А+В), (А+В).Максимальная синергическая активность у комоинаций очищенных макроциклических лактонов и депсппептидов была достигнута при соотношении около 1 - 2: 1. Примерно такие ке соотношения наблюдаются для ферментационных бульонов А. аигап(1 соог АТСС 31011 и для выделенных из них сырых смесей антибиотиков.Это явление противоположно наблюдаемому для др) гих синергических смесей антиоиотиков, для которых синергетические факторы наблюдаются у ферментационных бульонов и сырых смесей при бус-оптимальных соотношениях.Данные, полученные 1 п ио, при оральном и субкутанном введении при проведении опытов на мышах, инифипированных штаммом Яар)ду 1 ососсиэ ацгсц 01 Л 005, представлены в табл. 2.Антибиотики, охватыва. мые настоящим изобретением, могут применяться в качестве агентов стимулирования роста домашней птицы и животных из-за г ирокого бактерицидного спектра и при лечении дизентерии у свиных депсипептидов и очищенных макроциклических лактонов проявляют синергическую активность, являющуюся по существу бактерицидной.5 При индивидуальных испытаниях главногомакроциклического лактона - соединение36 926 (А) - и главного депсипептида - соединение37 277 (В) - или их комбинаций (путем разбавления в пробирках) против 10 различных организмов были выявлены минимальные ингибиру ощие концентрации. Результаты даны в табл. 1. 25ней благодаря значительной активности против анаэробной спирохеты, вызывающей это заболевание.Промотирующая рост активность сырой ЗО смеси антибиотиков определяется на молодыхпоросятах в течение 40 дней. Средний привес в день, потребление корма и эффективность оказались значительно улучшенными у животных, получавших антибиотики, по сравне нию с контрольными животными (р(0,01).Результаты приведены в табл. 3.Сходные результаты получены и для других смесей антибиотиков, применяемых в количестве 10 в 1 частей на 10 частей корма.40 Аналогичные результаты получены также прииспользовании .индивидуальных чистых соединений36 926, 37 932 и 3 277 или смесей чистых соединений.Таблица 3 Среднее дневное потребление корма, кг Эффективность кормления, кг корма/кг привеса Средний привес в день, кг Доза антибиотика части /10 частей корма0,91 0,25 о2,1510 1,35 50 0,63 Эффективность применения антибиотиков для стимулирования роста была продемонстрирована при проведении опытов на цыпля 15 тах, в корм которым вводили антибиотики, У них отмечается значительное улучшение привеса по сравнению с контрольными цыплятами (р(0,01). Результаты представлены в таол. 4, 20 Таблица 4 Эффективность кормления, кг корма/кгпривеса Доза антибиоСреднее потребле Средний привес г тика, части/10частей корма нпе корма г 939 949 10 608 1,56 30 Такие же результаты получены при применении других сырых смесей антибиотиков, со ставы которых приведены ниже, или использовании индивидуальных чистых соединений36 926, 37 932 и 37 277 или смесей чистых соединений.Профилактическую эффективность антибио тиков, охватываемых настоящим изооретением, определяют на свиньях, экспериментально инфицированных дизентерией.Корм, содержащий антибиотики, вводят в течение 28 дней. Полученные результаты 45 представлены в табл, 5,Таблица 5 Доза антибиотика, части(10 частей корма Среднийдневной 50 Смертность Заболеваемость %% привес, кг 50,00 37,50 25,00 12,50 6,25 Аналогичные результаты получены при введении (10 - 100 частей на 10 корма) чистых индивидуальных соединений36 926, 65 100 0 0 0 0 50 40 0 0 0 0 10- 0,13О,бб 550,570,680,610,4760 37 932 и 37 277 илн смесей чистых соединений.П р и м е р 1. Готовят стерильную воднуюсред состава (г/л):Глюкоза 10Растворимый крахмал 20Экстракт дрожжей 5Продукт энзиматическогодегидрированияказеина 5Карбонат кальция 1Величина рН 7Клетки с пластинки с А, ацгап 11 со 1 ог АТСС31011, выращенные на среде АТСС 172, переносят в несколько 300-миллилитровых конических колб Эрленмейера. в каждой из которых находится 50 мл этой среды и которыевстряхивают на вращаоц 1 емся сепараторе втечение 3 - 4 дней при 28 - 30 С, Аликвотныепорции по 5 мл выращен,ого инокулята переносят в 300-миллилитровые конические колбыЭпленмейера, каждая из которых содержит100 мл описанной выше стерильной среды,После встряхивания в течение 3 - 4 днейпри 28 - 30 С 5 - 10% выращенного инокчлятапереносят в четырехлитровый бродильный чан,соцеожащий 2 л сгерильной среды состава(г/л):Экстракт дрожжей 2,000Глюкоза 10,000Жидкость после замачивания кукурузы 1 (мл)Продукт энзиматическогодегидрированияказеина 5,000Хлорид двухвалентногокобальта 0,002Величина рН 7,0Ферментацию проводят 20 - 30 час при 28 -30 С, пои перемешивании со скоростью1700 обмин и аэрации 1 объем воздуха на1 объем бульона в 1 мин,В случае необходимости величину рН всего бульона устанавливают на уровне 7 и(1/3 - 1/2 от объема бульона). Экстракт в раство 1 ителе кочпентрипуют в вакууме и обезжиривают экстракцией петролейным эфиром.Активность бульона, экстракт в растворителеи последующие фракции контролируют методом тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованием системы проявителей,состоящей из хлороформа - этанола (9:1), ипроводят наблюдения в ультрафиолетовой области спектра при длине волны 254 ммк и336 ммк,Обезжиренный концентрат в растворителевысушивают досуха в вакууме. Твердые вещества подвергают противоточному распределению по Крэгу на шести тарелках с использованием толуола (5 частей), этанола (2 частей), водного фосфатного буферного раствора(рН 4,5; 3 части). После распределения слоиконтролируют методом тонкослойной хроматографии.14 55 60 б 5 13Депсипептид (соединение37 277) концентрируют в верхнем слое, в основном на нулевой тарелке. Второй депсипептид (соединение37 932) выделяют из верхних тарелок - 1-ой, 2-ой и З-ей, Макроциклический лактон (соединение35 763) находится в основном в нижних слоях тарелок 0-ой и 1-ой. Соединение36 926 концентрируют в нижних фазах тарелок 2-ой, З-ей, 4-ой и 5-ой.Верхнюю фазу нулевой тарелки, содержащую соединение37 277, высушивают досуха в вакууме, растворяют в хлороформе и перемешивают -30 мин с активированным углем. Раствор фильтруют и высушивают в вакууме. Остаток растворяют в ацетоне, твердые вещества осаждают, прибавляя гептан, Осадившиеся твердые вещества растворяют в небольшом количестве хлороформа и хроматографируют на колонке силикагеля, забуференного до рН 6,0, изготовленной в присутствии смеси хлороформа с н.-пропанолом (99: 1). Колонку проявляют той же системой под давлением 5600 Н/м. Фракции из колонки контролируют методом тонкослойной хроматографии. Фракции, содержащие выделенное соединение37 277, объединяют, выпаривают в вакууме, и соединение кристаллизуют из ацетона - гептана.Соединение37 277 не имеет отчетливой точки плавления. Разложение начинается при 140 в 1 С. Соединение нерастворимо в диэтиловом эфире, гексане, гептане и воде. Оно слегка растворимо в ацетоне и бензоле и легко растворимо в метаноле, этаноле, хлороформе и хлористом метилене.Анализ соединения37 277 дает следующие примерные результаты (о/о): С 60,91; Н 5,98; К 10,45; О (по разности) 22,66.Соединение37 277 оптически активно и25имеет угол вращения ао =+11 (с=1,0 этанол). Максимумы поглощения в ультрафиолетовой области находятся при длинах волн (ммк): 225, 274, 282, 303 и 355; е,"; 309,3; 36,67; 45,01 и 20. Хлороформный раствор показывает характерное поглощение в инфракрасной области при следующих длинах волн (мкм): 3,05; 3,40;5,70; 5,77; 6,07; 6,62; 6,82 и 7,67. Фракции, полученные при противоточном распределении и содержащие соединения35 763 и 36 926, выпаривают в вакууме, остатки растворяют в этилацетате, раствор перемешивают с силикагелем, Профильтрованный раствор выпаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате, твердые вещества осаждают, прибавляя гексан. Осадившиеся твердые вещества растворяют в небольшом количестве хлороформа и хроматографируют в колонке силикагеля, забуференного до рН 6,0, изготовленной в присутствии этилацетата, Колонку проявляют смесью этилацетата, тетрагидрофурана и гексана (80: 20: 20), насыщенной водным фосфатным 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 буферным раствором с рН 6,0, под давлением 5600 Н/м.Первые 17 из полученных фракций (каждая объемом 20 мл) содержат желтое масло, которое отбрасывают, Фракции 26 - 40 имеют высокое содержание соединения36 926. Фракции 41 - 50 представляют собой главным образом смеси соединений - 36 962 и 35 763. Фракции 26 - 40 объединяют, концентрируют в вакууме и вновь хроматографнруют на силикагсле с отбором фракций по 20 мл. Первые 15 фракций содержат желтое масло, которое отбрасывают. Фракции 16 - 30 представляют собой, в основном, соединение36 926, Фракции 31 - 40 содержат смесь соединений36 9 о 2 и35 763, Фракции 16 - 30 выпаривают в вакууме, остаток растворяют в небольшом количестве хлороформа и вносят в колонку силикагеля, забуференного до рН 6,0, изготовленной в присутствии хлороформа. Колонку проявляют смесью хлороформа с этанолом (95,5 - 4,5 об. о/О) под давлением 9100 Н/м и собирают 160 фракций по 6 мл. Фракции 60 - 90 содержат только соединение36 926. Эти фракции объединяют и выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в минимальном количестве этанола и осаждают диэтиловым эфиром для получения чистого аморфного соединения36 926,Соединение36 926 растворимо в метаноле, этаноле, хлороформе и хлористом метилене, нерастворимо в диэтиловом эфире, гексане и гептане. Оно не имеет отчетливой температуры плавления, разложение начинается при температуре 100 С. При анализе установлены следующие средние соотношения (% ): С 57,89; Н 6,78; М 8,04; О (по разности) 27,29.Молекулярный вес, определенный по массовому спектру с высоким разрешением, равен 501, молекулярная формула С 25 Нз 5 Йз 07.Соединение36 926 обладает оптической25 активностью с углом вращения а о = - 130 С (с = 1,0, этанол) . Максимум поглощения в ультрафиолетовой области спектра в растворе этанола находится при длине волны 214 ммк; е," =723,8.Таблетка с бромистым калием показывает характерные максимумы поглощения в инфракрасной области при следующих длинах волн (мкм): 2,95; 3,40; 5,75; 5,98; 6,23; 6,58;6,87; 7,45; 8,25; 8,38; 8,80; 9,08; 10,15;10,3 ь; 11,10 и 13,30. Соединение35 763 выделяют и очищают таким же образом, как и соединение36926. Чистое соединение растворимо в метаноле, этаноле, хлороформе и хлористом метилене, не растворимо в диэтиловом эфире, гексане и гептане. Оно не имеет отчетливой температуры плавления, разложение начинается при температуре -100 С. Анализ дает следующие средние соотношения (%): С 61,29; Н 6,73; К 8,83; О (по разности) 23,15.Молекулярный вес, определенный по массовому спектру с высоким разрешением, состав19,3 15,9 15,526,9 20,3 1,3 1,2 2,4 0,5 1,4 32,0 39,5 38,6 47,8 31,9 8,5 3,1 6,0 9,4 8 4 8,00 3,00 55 15ляет 503, молекулярная формула С 2 аН 371 Мз 07.Соединение35763 обладает оптической25 активностью и имеет угол вращения ар = - 114 (с=-1,0, этанол). Максимум поглощения в ультрафиолетовой области спектра в растворе этанола находится при длине волны 218 ммк при е,";=668,9.Таблетка с бромистым калием показывает в инфракрасной области спектра максимумы поглощения при следующих длинах волн (мкм): 2,95; 3,38; 5,73; 6,00; 6,23; 6,60; 6,88;7,23; 8,25; 8,38; 8,83 и 10,20,Фракции, полученные противоточным распределением, содержащие соединение37 932, выпаривают в вакууме досуха, остаток растирают с петролейным эфиром и хроматографируют на колонке силикагеля, как это было описано выше. Соответствующие фракции объединяют и производят кристаллизацию из ацетона в гекса для получения20 соединения37 932.Соединение37 932 растворимо в метаноле, этаноле, хлороформе и хлористом мети- лене. Оно не имеет отчетливой температуры плавления, разложение начинается при температуре - 185 С Элементарный анализ дает следующие приблизительные соотношения (%): С 59,41; Н 6,01; К 10,6; О (по разности) 23,92.Соединение37 932 обладает оптической25о активностью с углом вращения ао =+5,0 (с=0,25, хлороформ). Максимумы поглощения в ультрафиолетовой области спектра (в растворе этанола), находятся при длинах волн 226, 276, 283, 305 и 355 ммк с величинами е,";=304,4; 36,8; 43,49; 70,25 и 20,07 соответственно.Таблетки с бромистым калием показывают характерные максимумы поглощения при сле дующих длинах волн (мкм): 2,96; 3,05; 3,38;5,68; 5,93; 5,98; 6,13; 6,50; 6,58; 6,88;7,40; 7,65; 8,08; 8,45; 8,60; 9,03; 9,45;9,70; 9,98; 10,55; 11,00; 11,25; 11,60; 12,35 и 13,25. 45Пример 2, Опыт проводят по методике примера 1 и получают сходные результаты при применении ферментационных сред следующих составов (г/л):1. 50ГлюкозаТриптозаПродукт энзиматическогодегидрированияказеина 1,00Глутаминовая кислота 1,00 Мука из соевых бобов 0,50Хлористый натрий 8,30 Вторичный фосфат калия 2,40Первичный фосфат калия 2,00 60 16Хлорид двухвалентногомарганца11.ГлюкозаМука из соевых бобовЖидкость, полученная призамачивании кукурузы111.МелассаПродукт энзиматическогодегидрирования казеинаЭкстракт дрожжейЖидкость, полученная призамачивании кукурузыКазеин П р и м е р 3. Опыт проводят по методике примера 1. Полученный в метилизобутилкетоне экстракт готового ферм ентацион ного бульона выпаривают досуха в вакууме и остаток растирают с петролейным эфиром. Хрупкий материал размалывают, и количество антибиотических компонентов определяют жидкостной хроматографией под высоким давлением. Характерные партии сырых смесей антибиотиков, полученные при отдельных опытах ферментации, имеют различное содержание описываемых соединений. Результаты - в табл. 6. Формула изобретения Способ получения антибиотиков, о т л и ч ающи й ся тем, что культуру штамма Ас 11 пор 1 апез ацгап 11 со 1 ог АТСС 31011 выращивают в аэробных условиях в жидкой питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода и азота, с последующим выделением из культуральной жидкости целевого продукта в виде смеси соединений антибиотиков или отдельных компонентов ее. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1, Пагент США3780174, кл. 424 в 1, 1973,