Способ контроля чистоты проламина

)5 0 И ИЗОБ ЕТЕЛ ЬСТВУ ПИСААВТОРСКОМ 2 4ий государственныйлетия воссоединения.Сет,989, ч. 7) Использование: ыть использовано в обретение может отехнологии растеорганическихкак правило, н творит риводи еи или их смеси к исчерпывающе экстракцбелковойстовернората. ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЧИСТОТЫ ПРОЛАМИНА Изобретение относится к биотехнологии растений, технической биохимии и может быть использовано в качестве способа определения степени чистоты белков в процессе их выделения из растительного материала.Известны способы контроля чистоты препаратов проламина, которые заключаются в экстракции небелковых веществ органическим растворителем, удаления растворителя и определении веса сухого остатка примесей, При этом степень чистоты белкового препарата оценивают по содержанию экстрагируемых небелковых примесей (в ,ь к исходной навеске препарата). К недостаткам указанных методов следует отнести трудоемкость и длительность проведения экстракции, большой расход органических растворителей. Применение ний, практической биохимии для определения степени очистки белков в процессе их выделения из растительного материала. Сущность изобретения: проводят подготовку образца препарата к анализу путем пленки из раствора проламина в 700-ном диоксане на оптическое стекло, высушивают ее под вакуумом, регистрируют инфракрасный спектр проламина в области 2800-3700 см , определяют значение оптической плотности в максимумах поглощения при 2925-2930 см " и 3295-3310 см и рассчитывают отношение оптических плотностей в максимумах полос поглощения. Сравнивают полученное значение со значением для очищенного образца 0,35 - 0,55, Попадание отношения оптических плотностей в указанный интервал свидетельствует о чистоте препарата, 1 ил., 3 табл. ии примесей, прочно связанных с макромолекулой, что снижает дость оценки степени чистоты препаНаиболее близким техническим решением является способ, согласно которому очищенный препарат помещают в чашку Петри и определяют три индекса цветности на специальном приборе, измеряющем степень отражения интегрального светового потока(индекс ) ), а также отраженных красного и зеленого(индекс а), желтого и синего света (индекс в). Затем определяют аналогичные цветовые индексы стандартного образца (обезжиренная соевая мука). Степень чистоты определяют по величине трех цветовых индексов анализируемого препаратав сравнении со стандартным образцом и количеству осгэточных липидоа.Недостатками способа-прототипа являются трудоемкость, длительность анализа, необходимость использования большого количества образца (20 г). Способ не позволяет контролировать процесс очистки только по оптическим параметрам образца и требует проведения дополнительной экстракции липидных примесей.Целью изобретения является упрощение способа.Для достижения цели проводят подготовку образца препарата к анализу путем отливки пленки из раствора на оптическое стекло. Измеряют инфракрасный спектр проламина на спектрофотометре в области 2800 - 3700 см . определяют значения оптической плотности в максимумах поглощения при 2925-2930 и 3295-3310 см и рассчитывают их отношения. Белок считывается чистым, если зто отношение попадает в интервал 0,35-0,55,Интервал значений волновых чисел максимумов поглощения при 2925 - 2930 и 3295-3310 см обоснован экспериментально.В качестве иллюстрации способа приведены спектры поглощения проламина соргодо очистки (чертеж, кривая 1) и после гель- фильтрации на сефадексеН(чертеж, кривая 2).П р и м е р 1. В качестве чистых стандартных препаратов для установления диапазона значений показателя 01/02 использовались проламины, очищенные методом гель-фильтрации на сефадексеН, что является общепринятой процедурой для очистки проламиновых белков, Например, для очищенного указанным методом препарата зеина содержание основного компонента (белка), найденного известным методом, составляет 99.1%,Исследовали ИК-спектры этих препаратов проламина пшеницы (глиадин) и кукурузы (зеин), предварительно очищенных методом гель-фильтрации на колонке с сефадексомН - 20 в 70 б/-ном этаноле. Для подготовки тонкой пленки образца к анализу раствор 3 мг препарата в 0,5 мл 70 О-ного диоксана наносили на оптическое стекло из флюорита и высушивали под вакуумом. ИК- спектры проламинов получали на приборе Спекорд Мв области 2800-3700 см Оптические плотности 0/02 в максимумах поглощения при Уи Р 2 рассчитывали по методу базисной линии. Значения сравнительного показателя 01/02 приведены в табл.1 (ошибка измерения не более 57 ь).(01/02 = 9.25). трации дает возможность сделать вывод о45 том. чтохроматографическая фракция яв 50 55 5 10 15 30 35 40 П р и м е р 2. Исследовали ИК-спектры проламинов, выделенных из зерна злэковых культур путем экстракции 70-ным эталоном после отделения альбуминов и глобулинов, Очистку проламинов и получение ИК-спектров проводили аналогично примеру 1. Результаты определения сравнительного показателя проламинов до и после гель-фильтрации приведены в табл,2 (ошибка измерения не более 5 О/,).П р и м е р 3. Зеины выделяли из размолотого зерна кукурузы (линия А 204 о 2/о 2) после трехкратного обезжиривания муки петролейным эфиром путем зкстракции пятикратным объемом 70 о(,-ного этанола. Лиофилизированный белковый препарат очищали путем переосаждения, Для проведения очистки белок растворяли в минимальном объеме 70 % этанолэ и прибавляли охлажденный до минус 20" С ацетон (соотношение раствора белка и ацетона 1:9 по объ ему), Осадок, отделенный центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, представляет собой зеин после обработки ацетоном, а надосадочная жидкость - ацетоновый экстракт, Затем проводили гель-фильтрацию препарата зеина на колонке с сефадексомНв растворе 70 оь-ного этанола и получалиихроматографические фракции, ИК-спектры зеинов на различных стадиях очистки получали аналогично примеру 1, результаты определения приведены в табл,3 (ошибка измерения не более 5 оь).Величина критерия 01/02 позволяет контролировать эффективность очистки препарата зеина на различных стадиях. Так, после обработки ацетоном показатель для зеина уменьшается более, чем в 2 раза, напротив, ацетоновый экстракт представлен, в основном, небелковыми веществами Значение показателя после гель-фильляется чистым белковым препаратом(О/02 = 0,41), тогда кэкфракция представлена небелковыми веществами (0/02 = 2,67).П р и.м е р 4. Исследовали аналогично примеру 1 ИК-спектр зеина, полученного экстракцией 866-ним изопропэнолом из глютена (сопутствующий продукт кукуруза-крахмального производства) по известной методике, Максимумы поглощения в ИК-спектре препарата составили 2930 и 3300 см соответственно. Значение показателя 01/02 находится в интервале, установленном для очищенных проламинов, исоставляет 0,43.Формула изобретения Способ контроля чистоты проламина, заключающийся в определении оптического параметра для образца и в сравнении его величины со значением для очищенного образца. о тл ич а ю щ и й с я тем. что, с целью упрощения способа, отливают на оптическом стекле пленку проламина из раствора Таблица 1 Таблица 2 Р, см 92,см 01/ 02 Стадия очистки Характеристика и оламиновДо гельфильтрации После гельфильтрации2928 3295 0,43 До гельфильтрации После гельфильтрацииДо гельфильтрации После гельфильтрацииДогел ьфильтрации После гельфильт- рации в 70 -ном диоксане, высушивают ее пол вакуумом, регистрируют ИК-спектр в области 2800-3700 см, в качестве оптического-1параметра определяют отношение оптиче ских плотностей в максиммах полос поглощения при 2925 - 2930 см и 3295-3310 см и сравнивают полученное значение со значением для очищенного образца 0.35-0,55.каз 4188 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Произ нно-иэдате и комбинат "Патент", г, Ужгород. ул,Гагарина, 10