Способ определения наличия злокачественного процесса

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 3 50 51)5 6 ОСУДАР СТ В Е ННОЕ ПАТЕНТНОЕЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР) АНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К скии, Г.Я, яновлин 3.ЛИЧИЯ ризаци ьных с и. и ен не, в ожет и на- явлеьных ями,Изобретчастности к кбыть испольэселения с цения методомсо элокачестнезависимолевого проце иниится к медици онкологии, и м диспансеризаци остического вы криннинга) бол овообразовани локализации о ение относ линическои овано при лью диагн выбора (с венными н от стадии и сса. пухоОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 1(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ПРОЦЕССА(57) Использование: при диспансенаселения с целью выявления болзлокачественными новообраэовЦель: повышение точности и расш Известен способ диагностики злокачественных новообразований путем определения активности ферментов в сыворотке крови человека; изменение изоферментного спектра фермента лактатдегидрогенээы (ЛДГ). При сопоставлении активности изоферментов ЛДГ, а именно ЛДГ 5 и ЛДГ 1, определен термин "индекс малигнизации", значение которого при злокачественном росте опухолей превышает единицу. Однако широкое использование этого способа диагностики лимитировано сложностью выполфункциональных возможностей способа, Сущность изобретения: в сыворотке крови определяют магнийнезависимую ДНКаэную активность при рН 5,0 - 7,5 и количественное содержание перхлорнорастворимой фракции. При ДНКазной активности определяют наличие злокачественного процесса, а при отсутствии магнийнеэависимой ДН Казной активности и одновременном повышении показателя количественного содержания перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Е и более определяют наличие злокачественного процесса с метастазированием, Положительный эффект: высокая чувствительность при достаточной точности (82,7 ор) обеспечивает высокую степень выявляемости онкологических заболеваний. 2 ения исследовании, проводимых о-диагностической лаборатории,Известен способ раннеи диагностики а злокачественных новообразований путем определения в сыворотке активности фермента ДНКэзы 1, оптимальное действие которого выявляется в слабо щелочной среде гРН 7,4) при обязатаявном присутствии ионов магния. Активность Д Н Казы 1 в сыворотке крови человека определяют вискози- С) метрически по изменению вязкости коллоидного раствора ДНК после действия на него фермента. Находят относительную вязкость опытной пробы по отношению к воде до 2-часовой инкубэции в термостате и после нее. Опытная проба состоит из реакционных компонентов; сыворотки крови, натРи евой соли Д Н К и Рэ ство Ра М 9:у 04 (ионы магния), т.е. реакция идет в присутствии ионов магния в слабо щелочной среде- рН крови 7,4, Активность фермента выража3 1777080ют в относительных единицах - угловых градусах: угол 90 ф означает, что относительнаявязкость опы гной смеси эа время инкубации не изменилась, т,е, активность фермента ДН Казы 1 отсутствует. В сыворотке крови 5доноров (здоровые лица) активность ДНКаэы 1 отсутствует. Клинически выраженныйрак -Ч стадии также характеризуется отсутствием активности ДН Казы 1,При наличии активности ДНКазы 1 в 10сыворотке крови диагностируют рак толькона ранних стадиях ( - ),Этот способ не находит широкого применения для диагностики рака, так как имеет ряд существенных недостатков; 151. Выявляемость рака составляет всего48,2 : из 29 случаев рака положительнаяактивность ДН Казы 1 в сыворотке крови обнаружена только у.14 человек,2. Отсутствует вы я вляем ость- И стадии рака. особенно при недостаточно выраженной специфической симптоматикезлокачественного роста.3. Невозможно вискозиметрическое определение показателя количественного содержания еерхлорнорастворимой фракции,4. Способ не пригоден для диагностического выявления саркоматозных опухолей,при которых активность фермента чаще невыявляется, 305, Большие затраты времени на проведение анализа: время подготовки анализа,2-часовая инкубация в термостате, по 5-6отсчетов времени вытекания жидкостей ввискозиметре до и после инкубации, построение графика,Целью изобретения является повышение точности и расширение функциональных возможностей способа,Поставленная цель достигается тем, что 40определяют в сыворотке крови обследуемого лица магнийнезависимую ДНКазнуюактивность при рН 5,0-7,5 и одновременнопоказатель количественного содержанияперхлорнорастворимой фракции (ПФС) 45спектрофотометрическим методом при260 нм, При наличии магнийнезависимойДНКазной активности и нормальном илиповышенном показателе количественногосодержания перхлорнорастворимой фракции диагностируют наличие злокачественного процесса, при отсутствиимагнийнезависимой ДН Казной активностии одновременном повышении показателяколичественного содеркания перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Е и более определяют наличие злокачественного процессав запущенной стадии развития, т.е, с метастазированием; при отсутствии магнийнезависимой ДН Казной активности и нормальном показателе количественногосодержания перхлорнорастворимой фракции определяют отсутствие злокачественного процесса.Сравнение чувствительности на рак постадиям заболевания по предлагаемомуспособу и и рототи пу иллюстри руется табл,1.Способ осуществляется следующим образом.Процедура проведения анализа. Анализможно производить, только если больной вближайшие 3 - 5 месяцев не получал фитотерапии, химио- и лучевой терапии, не проводил самолечение ядами (например,сулемой, креолином и т,д.), а также не принимал биологически активных веществ (гормонов, нуклеотидов, адаптогенов и т,д.),. Подготовка анализа,а) Приготовление ехтетроге 0,05 раствора ДНК на 0,1 М ацетатном буфере: слегка перемешав коллоидный раствор ДНК,ставят его на ледяную баню на 1 ч, изредкаперемешивая мягким встряхиванием, Всерастворы и штативы с пробирками держатна ледяной бане и хранят в холодильнике,Затем раствор ДНК перед употреблениемщадяще центрифугируют,б) Подготовка сыворотки; забор кровипроизводят натощак свободным вытеканием (одной только иглой), Сыворотку быстроотделяют и держат на ледяной бане. Передупотреблениемее разводят ледяным физраствором в 10 раэ (1;9 по объему), перемешивают путем сильного встряхивания иотсасывают пастеровской пипеткой образующуюся пену, которую отбрасывают, Разведенную сыворотку держат на ледяной бане., Проведение анализа.1), Разлив реактивов производят в полиэтиленовые пробирки (объемом 3,5 - 4 мл) вледяной бане в следующем составе и порядке:а) опытные пробы; (5 параллелей) - к1 мл 0,05;4 раствора ДНК приливают 1 млразбавленной в 10 раз сыворотки;б) контроль (5 параллелей) - на содержание нуклеотидов в растворе ДНК: к 1 млфизраствооа приливают 1 мл 0,05 раствора ДНК.в) контроль(5 параллелей) (на количественное содержание перхлорнерастворимой фракции в сыворотке крови); к 1 млацетатного буфера приливают 1 мл разбавленной в 10 раз сыворотки крови;2), Инкубация после перемешивания путем тщательного встряхивания всех пробпри 37 С в течение 30 мин на водяной бане,3). Остановка ферментативной реакциипутем быстрого помещения всех проб в ледяную баню и быстрого добавления в кадую пробу по 1 мл раствора НС 104(до конечной концентрации в реакционной смеси 0,5 М НС 04). После тщательного встряхивания пробы оставляют на 1 ч в ледяной бане для лучшего формирования осадка.4). Центрифугирование при 4000 об/мин в течение 10 мин,5), Слив надосадочной жидкости и спектрофотомегрирование при 260 нм.6), Расчет магнийнезависимой ДНКазной активности и выражения показателя количественного содержания перхлорнорастворимой фракции сыворотки(ПФС) крови;а) рассчитывают истинную оптическую плотность в экстинкциях опытной пробы (ЬЕо) путем вычитания из среднеарифметического показателя оптической плотности опыта суммы среднеарифметических показ,".телей плотности обоих контоолейипо формулеЛЕо - Ео - (Е к+.Еки)Обнаружение положительной ферментативной активности следует считать со значения ЬЕо = 20 Е и выше с учетом расхождения в параллельных пробах (+10 Е) и возможной ошибки прибора (+5 - 10 Е), ДНКазную активность условно можно выражать в величинах Л Ео в экстинкциях,По международной системе СИ производят расчет в мкмоль/(л мин) кислоторастворимых нуклеотидов, образовавшихся за 1 мин инкубации 1 л сыворотки крови с субстратом ДНК, Количество мкмолей кислоторастворимых продуктов гидролиза ДНК находят по калибровочной кривой, построенной для АМФ или по коэффициенту пересчета К, выведенному по этой кривой.Расчет по формуле:Л Ео х 10000 х К30где 10000 - пересчет объема 0,1 мл сыворотки крови в реакционной смеси на 1 л сыворотки; 30 - количество минут инкубациипроб.Показателем количественного содержания перхлорнорастворимой фракции в сыворотке крови (ПФС) служит среднеарифметический показатель оптический плотности контроля 11, выраженный в экстинкциях.Изобретение иллюстрируется следующими примерами. П р и м е р 1. Больная В., 1933 года рождения, ист, болезни ч. 2334/м, прооперирована в гинекологическом отделении Ростовского НИИ онкологии с диагнозом: рак тела матки, стадия 11; гистоанализ: аденокарцинома тела матки с инвазией мышечного слоя (М гистоанализа: 290 269 - 78).30 процесса, состоит в его высокой чувствительности (96 ) при достаточной точности 35 40 50 5 10 15 20 25 Диагностический анализ крови до операции; от 15,03.88,ДНКазная активность 0,756 лк моль/л/мин, показатель ПФС - перхлорнорастворимой фракции сыворотки 0,162 Е.П р и м е р 2, Больная М., 1922 года рождения, история болезни М 7073/Ф, прооперирована в институте, в гинекологическом отделении, с диагнозол: кистома правого яичника и миома матки (М гистоанализа 236 496-502),Диагностический анилиз: кровь до операции от 22.06,88.ДНКазная активность 0; показатель ПФС 0,065 Е,П р и м е р 3. Больная Т 1935 года рождения, 1 Ф ист. болезни 501/Ф. прооперирована в гинекологическом отделении института с диагнозом; рак яичников, стадия И. Гистоанализ ч. 228 566 - 79: цистоденокарцинома с метастазами в большой сальник, Диагностический анализ крови от 14.01.88 до операции: ДНКазная активность О, показатель ПФС 0,218 Е,Доказательства положительного эффекта. предлагаемого способа представлены втабл 2,ЭФфективность способа диагностики,способа определения злокачественного(82,7%) к наличию злокачественного роста в организме больного и, следовательно, высокой степени выявляемости онкологических заболеваний, Заявляемый способ отличает ся простотой выполнения, небольшой затратой времени (на обследование 2 - 4 человек не более 3 ч) - анализы идут параллельно, не требуют использования сложной,уникальной аппаратуры, и может найти широкое применение при диспансеризации населения как диагностический метод скриннинга (выбора) по определению наличия злокачественного новообразования в организме человека с целью выявления лиц, нуждающихся в тщательном онкологическом обследовании и дальнейшем проведении специфического лечения, Формула изобретения Способ определения наличия злокачественного процесса путем биохимического исследования сыворотки крови, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения точности и расширения функциональных возможностей способа, в сыворотке крови пациента определяют магнийнезависимую ДНКазную активность при рН 5,0-7,5 и количественное содержание перхлорнорастворимой фракции спектрофотометрически при 260 нм, и при ДНКазной активности1777080 держания перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Е и более определяют наличие злокачественного процесса с метастазированием.Табли а 1 определяют наличие злокачественного процесса, а при отсутствии магнийнезависимой ДН Казной активности и одновременном повышении показателя количественного сотрицательных и л лизам, выполн Таблицанополокительных ответов по диагностическим ананым предлагаемым способом оличество ло Доброкачественные опухоли, хронические воспалительные и оцессылокачественные опухол окалиэаци Общее количество больных гистоанализо Общее ко личество больных гистоанализом СовпадениеНесовпаде ние (ложно- отрицательные ответы овп ни0(4 т ельные сл ча 3,7 69 66 ктор Г, Бельская Техред М.Моргентал Корректор О, Крав Заказ 4120 Тирак ПодписноеВНИИПИосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 й комбинат "Патент" од жгород, ул.Г ина, 101 о-издател Желудочно-кишечный тракт Тело и шейкаматки ЯичникиЛегкиеМолочная