Устройство для изоэлектрофокусирования и препаративного электрофореза

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 2712 А 1 51)5 0 01 М 27/453 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ И К АВТОРСКОМУ. СВ ЕЛЬСТВУ гии и биов, В.А.Куикроаналиания. Науч,ССР 2.ЕКТРОФОТИВНОГО ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР(71) Институт молекулярной биолхимии АН КазССР(56) Остерман Л, Колонки для мтического изоэлектрофокусировное обозрение, ЛКБ, т,17, М 2, 1Авторское свидетельство СМ 881600, кл. 6 01 й 27/26, 198(54) УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗОЭЛКУСИРОВАНИЯ И ПРЕПАРАЭЛ Е КТРОФО РЕЗА Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к устройствам для препаративного разделения макромолекул способами изоэлектрофокусирования и электрофореза,Известно устройство для изоэлектрофокусирования, содержашее колонку, помещенную в охлаждающую рубашку, электроды верхнюю пробку с отверстиями, одно из которых служит для отвода газов от колонки, другое - для отвода газов от платинового анода, нижнюю пробку со штуцером для слива рабочей жидкости. Однако устройство сложно в изготовлении, исключена возможность вариации объема пробы, необходимо строгое соответствие уровней катодного и анодного буфера и их плотностей.Известно устройство для изоэлектрофокусирования. содержащее колонку, размещенную в рубашке охлаждения, электроды, причем нижний представляет собой пробку, выполненную из графита и имеющую осевое(57) Использование; изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к устройствам для препаративного разделения макромолекул способами изоэлектрофокусирования и электрофореза, Сущность изобретения: в устройстве, состоящем из колонки с рубашкой охлаждения, электродов, сосуда для электродной жидкости, применяют гелевый элемент, обеспечивающий герметизацию рабочего обьема колонки и тем самым уравновешивание гидростатического давления жидкости, электропроводность и предотвращение прохождения пузырьков газа через рабочий объем колонки, 3 ил,отверстие для содержимого колонки. а также целлофановую мембрану, отделяющую содержимое колонки от графитового электрода,Недостатком устройства является необходимость изготовления специального графитового электрода, диаметр которого токарной обработкой доводится до соответствия с внутренним диаметром используемой колонки, Кроме того, конструкция требует использования специальных видов диализных мембран.Целью изобретения является упрощение устройства и повышение качества разделения, Поставленная цель досгигается тем, что в устройстве для изозлектрофокуси. рования, состоящем из разделительной колонки с рубашкой охлаждения, капилляра для вь 1 ведения фракций из колонки, расположенной в нижней части колонки и электрода, выполнено отверстие, расположенное соосно капилляру для выведения фракций вдне нижнего электродного сосуда размещен гелевый герметизирующий элемент, верхний край которого расположен на одном уровне с верхним концом капилляра, и выше нижнего торца разделительной колонки, электрод погружен в буферный раствор, размещенный поверх гелевого элемента, а нижний торец капилляра размещен ниже дна нижнего электродного сосуда.На фиг. 1 показана конструкция предлагаемого устройства,Устройство работает следующим образом.В цилиндрический сосуд 2 опускается стеклянная колонка с охлаждающей рубашкой 1 таким образом, чтобы капилляр 3 располагался по центру колонки, Между нижним торцом колонки и дном цилиндрического сосуда оставляется зазор 2 - 3 мм. В цилиндрический сосуд заливается токопроводящий гель 4 (например, агароза или полиакриламидный гель), приготовленный на нижнем электродном буфере, в таком количестве, чтобы высота геля внутри колонки 1 находилась на одном уровне с верхним срезом капилляра 3, После полимеризации или застывания геля, внутренний объем колонки заполняется рабочим раствором, Истечение рабочего раствора из колонки через - капилляр 3 предотвращается зажимом 8, расположенном на эластичном шланге 7, применяемом при фракционировании содержимого колонки 1, Ввиду того, что устройство может быть использовано как для электрофореза в жидкой фазе, так и изоэлектрофокусирования, рабочие и буферные растворы могут быть различного состава, В нижний цилиндрический сосуд заливается буферный раствор 5 и опускается электрод б, выполненный из любого инертного электропроводящего материала (например платина, графит), На рабочий раствор колонки, высота которого не доходит до ее верхнего торца, наслаивается верхний электродный раствор 9, в который опущен электрод 10, Г 1 ри подаче постоянного напряжения на электроды колонки через рабочий и буферные растворы и гель, течет электрический ток, величина которого зависит от электропроводности растворов и геометрических размеров колонки, что позволяет использовать устройство как в аналитических. так и в препаративных целях;Предлагаемое устройство отличаетсяпростотой изготовления, исключающей токарные работы. Конструкция его может быть изготовлена из доступных материалов, устройство присуще высокая эффектив 10 30 35 заполнения внутреннего объема колонки рабочим раствором с разделяемой смесью 50 55 представлен на фиг. 2,б) Препаративный электрофорез в жидкой фазе,Рабочий раствор колонки, электродныерастворы и герметизирующий гель готовились на трис-глициновом буфере рН 8,3, Для 15 20 ность разделения, обусловленная отсутствием перемешивания рабочего раствора газами, образующимися на электродах, низкие экономические. затраты на изготовление и большой диапазон варьирования рабочих объемов колонки, снижения перемешивания фракций при раскапывании содержимого колонки. обусловленное наличием капилляра,П р и м е р 1. а) Изоэлектрофокусирование белков в жидкой фазе. В качестве модельной смеси использовали очищенный препарат а-амилазы зерна пшеницы содержащий ряд изоформ, в смеси с очищенным препаратом глутаматдегидрогеназы. Сбор-, ка устройства и его подготовка к работе проводилась как описано в описании, В качестве рабочего раствора использовали 2,-ный раствор амфолинов производства фирмыКВ,РЬагеаса Швеция), или Алмалит (Алма-Ата, КазГУ). Диапазон,рН от 4 до 9, Рабочая среда стабилизировалась линейным градиентом сахарозы или глицерина в диапазоне концентраций от 15 до 5 ,Смесь белков вносили в объем рабочего раствора при заполнении колонки. В качестве герметизирующего слоя использовался 5 О- ный полиакрипамидный гель, который готовился на 0,05 М уксусной кислоте, После полимеризации геля на него наслаивали 0,05 М раствор уксусной кислоты, в которой опускался платиновый электрод, соединенный с положительным полюсом высоковольтного источника напряжения. После белков на столб рабочего раствора наслаивали 0,05 М раствор йаОН, в который опускался платиновый электрод, соединенный. с отрицательным полюсом высоковольтного источника питания. Через водяную рубашку колонки пропускался ток охлаждающей жидкости с температурой 2 - 4 С, При. подаче электрического тока через колонку регистрировали следующие параметры: напряжение 600 В, ток 30 мА, По окончании фокусирования, что регистрировалось по достижению постоянной величины тока,равной 2-5 мА (конечное напряжение 1000 В), источник питания отключался и содержимое колонки раскапывалось по фракциям 2-3 мп, в которых анализировалась активность разделяемых ферментов. График распределения активности по фракциямпредотвращения конвекции использовали линейный градиент глицерина или сахарозы в диапазоне от 25 до 5 О. Разделяемые белки, смесь а-амилаэы и ГДГ растворялись в 3-ной сахарозе содержащего следы бромфенолового синего на буфере того же состава, Эта смесь наслаивалась на столб рабочего раствора, а по верх нее наносили электродный буфер. Нижним электродом являлся анод, На электроды подавалось напряжение 150-200 В, а ток составлял 30 мА, Об окончании процесса разделения судили по выходу красителя - бромфенолового синего. Содержимое колонки фракционировали через капилляр по 2-3 мл. Распределение активности разделяемых ферментов по фракциям приведено на фиг, 3.Формула изобретения Устройство для изоэлектрофокусирования и препаративного электрофореза, включающее разделительную колонку с рубашкой охлаждения, капилляр для выведения фракций из колонки, расположенный в нижней части колонки. и электроды, о т л и ч а ю щ е е с я тем, что, с целью упрощения устройства и повышения качества разделения путем устранения попадания пузырьков газа в разделительную олонку. в дне нижнего электродного сосуда выполнено отверстие, 10 расположенное соосно с капиллярами длявыведения фракций, а на дне нижнего электродного сосуда размещен гелевый герметизирующий элемент, верхний край которого расположен на одном уровне с верхним кон цом капилляра и выше нижнего торца разделительной колонки, электрод погружен в буферный раствор, размещенный поверх гелевого элемента, а нижний торец капилляра размещен ниже дна нижнего электродного 20 сосуда,,6 2 0,5 0,3 б, Я ражгл Корректор М Максимиши едак каз 3842 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьпиям при ГК 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 водственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Га ОБ 1,оСостави Техред ель С,фурсов ,Моргентал