Способ выявления эндоспермовых мутаций кукурузы

(51)5 А БРЕТЕНИ САНИ ОСПЕРОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Днепропетровский государственный университет им, 300-летия воссоединения Украины с Россией(56) Палий А.Ф. Генетические аспекты улучшения качества зерна кукурузы. Кишинев: Штиинца, 1989, с, 23.Огоцап С.Р., В еззп С.ЧЧ., Сгор Яс епсе, 1986, Чо, 8, В 6, р, 730-732. Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к генетическим исследованиям зерновых культур, и может быть использовано в селекционной практике для отбора перспективных форм кукурузы с хозяйственно ценными признаками,Генетические приемы, используемые в селекционной практике, позволяют улучшать качество зерна кукурузы. Одним из показателей, определяющих биологическую ценность, является содержание и качественный состав каротиноидного комплекса зерна. В связи с этим возникает необходимость разработки способов определения влияния эндоспермовых мутаций на каротиноидный комплекс как показатель качества зерна. Известный способ выявления эндоапермовых мутаций включает выделение и количественное определение каротина в зерне. При этом степень воздействия мута(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНД МОВЫХ МУТАЦИЙ КУКУРУЗЫ(57) Использование: биотехнология, сельское хозяйство, селекция и семеноводство. Сущность изобретения: экстрагируют каратиноидный комплекс зерна, измеряют спектр поглощения раствора в области 350- 600 нм, находят значения оптической плотности в максимумах при 445-450 и 368 - 370 нм и рассчитывают их отношение, По уменьшению рассчитанного отношения у исследуемых форм по сравнению с исходной формой выявляют эндоспермовую мутацию.1 ил., 1 табл,ции на исходный генотип выявляют по изменению суммарного содержания каротина.К недостатку способа следует отнести то, что сравниваемый показатель отражает только количественное накопление каротиноидов и не дает возможности оценить влияние эндоспермовой мутации на качественный состав каротиноидного комплекса.Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий выделение каротиноидного комплекса зерна кукурузы, разделение на основные каротиноидные фракции и определение их относительного содержания.Согласно способу навеску целого зерна кукурузы (50 г) дважды экстрагируют диэтиловым эфиром для удаления восковой оболочки, высушивают и размалывают. Навеску муки встряхивают со смесью абсолютного этанола, воды и 60 едкого натра в течение50 10 мин при 50 С. Воздух над образцом уда. ляют пропусканием газообразного азота, Образец выдерживают при комнатной температуре в темноте 16 ч с последующим встряхиванием при 50"С в течение 10 мин, Растворитель удаляют центрифугированием. Остаток экстрагируют трижды абсолютным зтанолом по описанной процедуре. Экстракты обьединяют и упаривают до объема 100 мл на роторном испарителе. Затем к смеси добавляют 200 - 300 мл воды и проВодят Голную зкстракцию каротиноидов порциями дизтилового зфира по 100 мл, Остаточные количества едкого натра удаляют из объединенных зкстрактов последова,тельным промыванием водой с использованием фенолфталеина для контроля присутствия щелочи в водной фазе, После высушивания над безводным сульфатом натрия дизтиловый эфир удаляют на роторном испарителе, Остаток растворяют в гексане для проведения хроматографии, Для разделения каратиноидных фракций испол ьзуется хроматографическая колонка, наполненная слоем адсорбента и безводного сульфата натрия. После нанесения каротиноидной смеси на колонку под вакуумом колонка обрабатывается сухим азотом, Основные каротиноидные фракции (каро- тины, зеиноксантин, криптоксантин, лютеин, зеаксантин, полиоксисоединения) последовательно злюируются из колонки Органическим растворителем,Идентификацию каротиноидных фракций проводят с использованием спектров поглощения, Количественное содержание рассчитывают по величине оптической плотности при аналитических длинах волн, используя известные коэффициенты зкстинкции для каждой каротиноидной фракции, Относительное содержание основных каротиноидных фракций определяют как процент от суммарного содержания каротиноидов и используют в качестве показателя для сравнения изменений состава каротиноидного комплекса селекционных образцов кукурузы.Основными недостатками способа является его длительность и трудоемкость. Например, исчерпывающее выделение каротиноидов проводится путем зкстракции растворителем в течение 64 ч (четыре стадии по 16 ч), Способ включает в себя трудоемкие операции по хроматографическому разделению каротиноидных фракций, необходимость работы с газообразным азотом, вакуумирование образцов, предварительную подготовку образца зерна к анализу, абсолютирование этанола и т,д, Длительная и трудоемкая методика позволяет провести 10 1 д 20 25 30 35 40 анализ образца за несколько суток, требует большого количество селекционного материала и расхода химических реактивов, дефицитных хроматографических сорбентов,что существенно ограничивает практическое использование указанного способа в селекционной практике.Цель изобретения - упрощение и ускорение способа.Способ осуществляют следующим образом,Проводят зкстракцию каротиноидного комплекса смесью ацетон - гексан (1:1 по обьему) из размолотого зерна кукурузы параллельно для исходного и исследуемого образцов, Раствор каротиноидов отделяют фильтрованием. Измеряют спектр поглощения раствора в области 350-600 нм, находят значения оптической плотности В максимумах поглощения при 445-450 и 368 - 370 нм и рассчитывают соотношение оптических плотностей при указанных максимумах в качестве сравнительного показателя. Эндоспермовую мутацию выявляют по уменьшению Величины сраВнительногО показателя по отношению к исходной форме.На чертеже приведены спектры поглощения каротиноидного комплекса исходной (кривая 1 - +/+) и мутантных ,кривая 2 - о 2/О 2; кривая 3зр 2/зц 2; кривая 4 - о 2/о 2 вц 2/ЗО 2) фОрм кукурузы (линия Ю 64 А),Интервал значений длин волн 368-370 нм ( Ъ ) и 445-450 н, Ж) обоснован зкспериментально, При атом соотношение оптических плотностей является маркерным признаком для максимумов поглощения при указанных длинах волн,Отличительными особенностями способа являются анализ по спектру поглощения растВора каротиноидного компле 1(са зерна и выявление зндоспермовых мутаций по соотношению оптических плотностей В максимумах поглощения.П р и м е р, Проводят экстракцию каротинсидного комплекса из образца размолотого зерна кукурузы (1,5 г) смесью ацетон - гексан (1:1 по обьему) (5 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Экстракцию проводят параллельно для исходного и исследуемого образцов. Раствор каротиноидов отделяют фильтрованием, Измеряют спектр поглощения раствора в области 350-600 нм на спектрофотометре Спекорд Ь 40 в 1 см кювете,По полученному спектру находят значения оптической плотности в максимумах поглощения 368 - 370 нм (Й ) и 445 - 450 нм (А 2 ) и рассчиты валат соотношение оптической плотности при указанных максимумах для0,55 0,57 0,9,б 0,60 0,37 0,2;2 0,9,0 0,58 1, 1,4 0,7 Ь О, 6 0,77 0,5 0,5 0,5 0,3 0,2 0,8 450 447 447 449 447 370 370 370 370 370 368 370 92 07 447 448 448 446 446 370 370 370 82 г,сравнения О 2/О). Результаты определения сравнительного показателя для каротинаиднаго комплекса зерна кукуоуэы с эндоспермовыми мутациями типа а 2, зц 2, вх, о 2/о 2 зц 2/зо 2, о 2/о 2 ах/дх приведены в таблице данные статистически достоверны, ошибка измерения не более 5 ЯПолученные результаты свидетельствуют а там, чта предлагаемый способ позволяет выявить эндоспермовые мутации кукурузы различного типа по снижению соотношения О 2/О в спектрах поглощения каротиноидного комплекса зерна в сравнении с известным, а также определить степень воздействия эндоспермавых мутаций на каратиноидныл комплекс зерна в зависимости от исходного генотипа. Например, для линии Я 64 А мутация типа о 2/а 2 оказывает более заметное влияние на каротиноидный комплекс зерна в сравнении с мутациями типа ьц 2/зц 2 или а 2/о 2 зц 2/зц 2.Результаты приведены в таблице.Использование предлагаемого способа. в сравнении с известным позволит упростить и ускорить проведение отбора путем исключения длительных и трудоемких операций, уменьшить количества анализируемого селекционного материала. При этом исчерпывающая экстракция каратинаидов не является обязательной, так как предлагаемый маркерный признак связан с изменением качественного состава каротиноидов, проявляющимся в спектре поглощения, 5 Предлагаемый способ прост в техническом исполнении и позволяет существенно повысить интенсификацию селекционной диагностики для выявления сортообразцов кукурузы с хозяйственно ценными приэна ками,Формула изобретения Способ выявления эндоспермовых мутаций кукурузы, включающий выделение ка ратинаиднога комплекса зерна, измерениеоптических параметров и определение наличия мутаций по изменению оптических параметров исследуемых форм в сравнении с исходной, отл ича ю,щи йся тем,что, 20 с целью упрощения и ускорения способа, вкачестве измеряемого оптического параметра исследуют спектр поглощения раствора каратинаидного комплекса в области 350-600 нм, определяют значения оптиче ских плотностей в максимумах поглощенияи о наличии мутаций судят по уменьшению отношения значения оптической плотности в максимуме при 445-450 нм к значению оптической плотноСти в максимуме при 30 368-370 нм.дактор А, Козориз Т Корре обылянска каз 1522 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС . 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 зводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101