Способ выявления микобактериального антигена

(5)5 ЕТЕН АВТОРСКО ВИДЕТЕЛ ЬСТ изировднноного раствоГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РСФСР(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО АНТИГЕНА(57) Использование: иммунология, диагностика инфекционных болезней. Сущностьизобретения: к 0,10-ной водной суспензиилатекса АКРрН 7,6 - 7,8 добавляют у-глоИзобретение оа именно к диагнолезней,Цель изобретения - повышение точности способа,П р и м е р 1. Постановка реакции латекс-агглютинации с антигеном изМ,зп)е 9 гпабз.К 0,5 мл 0,1%-ной водной суспензии ла- .текса АКР - 2 (рН 7,6-7,8) добавляют 10,0 мгу-глобулина, выделенного из гипериммунной кроличьей антисыворотки . кМ,звецгласз. Смесь инкубируют в течение3 ч при комнатной температуре с осторожным помешиванием. Сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированиемпри 3000 об/мин и отмывают от несвязавш е го с я у-глобулйна бидистил лиро ваннойводой (рН 7,6 - 7,8) однократно. Свободныеальдегидные группы латекса блокируют 1%ным водным раствором глицина(рН 8,6 - 8,8) тносится к иммунологии, стике инфекционных бобулин, выделенный из гипериммунной кроличьей антисыворотки к микобактериям. Смесь инкубируют 3 ч при комнатной температуре. Сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием от несвязавшегося у-глобулина, отмывают бидистиллированной водой рН 7,6-7,8 однократно. Свободные альдегидные группы латекса блокируют 1%-ным водным раствором глицирина рН 8,6 - 8,8 в течение 30 мин при комнатной температуре, Полученный коньюгат суспендируют в 10-ном растворе глицина рН 8,6 - 8,8. Постановку реакции агглютинации латекса осуществляют в 1- ном водном растворе глицина. 1 табл,в течение 30 мин при комнатной температуре, Полученный конъюгат суспендируют в 2,5 мл 10-ного раствора глицина (рН 8,6- 8,8). Контрольный коньюгат - . латекс после инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в 10-ном водном растворе глицина. Постановку реакции проводят в планшетах для иммунологических реакций, Антиген готовят из М.заедщабз путем ультразвукового разрушения бактериальных клеток. Концентрация белка в первой лунке 100 мкг, Титрование до разведения 1;1024 проводят двухкратным разведением его 10- ным водным раствором глицина (рН 8,6). В каждую лунку с 50 мкл раствором антигена добавляют по 50 мкл антительного латексного диагностикума. Контроль: 50 мкл сенсибго латекса и 50 мкл 10/О-ного вра глицина (рН 8,6);45 50 55 50 мкл контрольного латекса и 50 мкл1 -ного водного раствора глицина (рН 8,6);20 мкл контрольного латексэ и 50 мклраствора антигена в первом разведении.В реакции с сенсибилизированным латексом агглютинация с образованием "зонтика"наблюдалась в титре 1;32, зонтик- в титре 1:64, "кружок" (+) - в титре1:128.В контрольных пробах все реакции от. рицательные (осадок в виде точек),П р и м е р 2. К 5,0 мл 0,1 -ной воднойсуспензии латекса (рН 7,6) добавляют10,0 мгу-глобулина, выделенного из гипериммунной кроличьей антисыворотки кМ.ачопт, Смесь инкубируют в течение 3 чпри комнатной температуре, осторожно помешивают. Сенсибилизированный латексосаждают центрифугированием при3000 об/мин и отмывают от несвязавшегося у-глобулина бидистиллированной водой(рН 7,6) однократно. Свободные альдегидные группы латекса блокируют 1-ным водным раствором глицина (рН 7,6) в течение30 мин при комнатной температуре. Полученный коньюгат суспендируют в 2,5 мл1 ф,-ного водного раствора глицина (рН 8,8).Контрольный конъюгат - латекс после инкубации в 1 -ном водном растворе глицина(рН 7,7) в течение 30 мин при комнатнойтемпературе. Антиген из М,ачало готовятпутем ультразвукового разрушения бактериальных клеток. Концентрация антигена впервой лунке 200 мкг. Титрование антигена проводят 1 -ным водным растворомглицина (рН 8,8) способом двукратного разведения, В каждую лунку с 50 мкл раствораантигенэ добавляют по 50 мкл антительноголатексного диагностикума. Контрольныепостановки реакции латекс-агглютинации,кэк в примере 1.Агглютинация частиц лэтексэ наблюдалась до титра 1:512,В контрольных пробах все реакции были четко отрицательные (осадок латекса ввиде точек).П р и м е р 3. К 0,5 мл 0,1 -ной воднойсуспензии латекса (рН 7,8) добавляют10,0 мкгд-глобулина, выделенного из гипериммунной кроличьей антисыворотки кМ.чачае, Дальнейшая обработка латекса,как в примере 2, с использованием для отмывки коньюгата бидистиллированной воды (рН 7,8), а для блокирования свободныхальдегидных групп - 1 -ного водного раствора глицина (рН 7,8). В качестве рабочегоиспользуют 1 -ный водный раствор глицина (рН 8 8). Реакцию латекс-агглютинациипроводятссуспензией клеток БЦЖ, концен 5 10 15 20 25 30 35 40 трация которых в первой лунке 75 мкг, Постановка реакции и контроль, как в примере1. Агглютинация частиц латекса наблюдалась до концентрации бактериальных клеток 4,5 мкг.В контрольных пробах все реакции были четко отрицательные (осадок латекса ввиде точек),Сравнительная постановка реакции аг-глютинации латекса с антительным латекСным диагностикумом, полученнымсенсибилизацией антителами противМ.Ьовз в водной среде (рН 7,8), осуществляют с антигенными препаратами изМ,Ьочз, ВСЯ, М.мЬегсоозфз, М.ачов,Млог 1 атцгп, Млае 9 гпатз.По предлагаемому способу(разводящаяжидкость:.1 -ный водный раствор глицина,рН 8,6), а по известному способу разводящая жидкость: 1 -ный раствор глицинэ в0,85/-ном растворе КаС 1, забуференномфосфатным буфером, рН 8,6.Исходная концентрация белка в исследуемых дезинтегратах микобактерий2 мг/мл; исходная концентрация микобактериальных клеток 1,5 мг/мл.Полученные результаты приведены втаблице,Результаты реакции контрольного латекса с исследуемыми препаратами попредлагаемому способу во всех реакцияхбыли отрицательными. В сравниваемомспособе во всех разведениях с контрольнымлатексом наблюдалась спонтанная агглютинация,Таким образом, сенсибилизация латекса антителами в бидистиллированной водеи постановка реакции в водным раствореглицина позволяет повысить специфичность реакции латекс-агглютинации за счетликвидации явлений спонтанной агглютинации,Формула изобретения Способ выявления микобактериального антигена, включающий сенсибилизацию латекса антителами при рН 7,6-7,8, блокаду свободных альдегидных групп глицином при рН 7,6 - 7,8, смешивание полученного диагностикума с раствором исследуемого микробного дезинтеграта при рН 8,6 - 8,8 и учет результатов по агглютинации латекса, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности, сенсибилизацию латекса проводят в бидистиллированной воде, а перед смешиванием диагностикум и микробный дезинтеграт разводят в 1 -ном водном растворе глицина,)Я 3 Е Э з 9 о о Л фа1 ЭХ КК ЕаЭЧ О+аттУс оф 3 а:9Б чЕ Ел Фхх фЭт ха ое чШО Ооо11 Э:У ХО уохХ3- Ох со хИ ла