Способ определения липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови

(51)5 6 01 й ЗЗ/52, 33/53 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН х 100%, (1 ДЕ 1-1 - ИНтЕнсивензии липосом;Р 2 - интенсивензии липосом сисыворотки и комРз - интенсивии липосом сантисыво рот ость флуоресценции с ость флуоресценции сдобавкой стандартной племента: ость флуоресценции сдобавкой только стэнд и; енз ной ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНЫХ АНТИГЕНОВ МИКРООРГАНИЗМОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в иммунодиИзобретение относится к микробиологии и может быть использовано в иммунодиагностике инфекционных заболеваний.Цель изобретения - повышение точности способа.Способ осуществляют следующим образом,Осуществляют встраивание определяемого антигена (АГ) в мембрану липосом, включение маркера внутрь липосомы, проведение реакции комплемент-зависимого лизиса с последующим определением АГ по выходу маркера из лизированных липосом. Перед включением маркера определяемый АГ обрабатывают 0,1 й щелочью при нагревании до 950 С в течение 10 мин. В качестве маркера используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальцин. Определяагностике инфекционных заболеваний. Цель изобретения - повышение точности способа. Определяемый антиген обрабатывают 0,1 н.щелочью при нагревании до 95 С в течение 10 мин, встраивают его в мембрану липосом, внутрь липосомы включают маркер, в качестве которого используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальция, и определяют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплементзависимого лизиса и по рассчитанной доле иммунного лизиса по калибровочной кривой определяют концентрацию липополисахаридных антигенов. Способ позволяет повысить точность определения в 2-3 раза. 3 табл,ют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплемент-зависимого лизиса липосом с контролями и рассчитывают долю иммунного лизисэ по выражению5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Р 4- интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой только комплемента;Р 5- интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой сыворотки больного и комплемента;Г 6 - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой сыворотки больного, комплемента, стандартной антисыворотки.Концентрацию липополисахаридных антигенов определяют по калибровочной кривой.П р и м е р 1. Получение липосомального иммунореагента.Раствор липидов - яичный лецитин, холестерин, дицетилфосфат(в малярном соотношении 2:1, 5."0,22) в смеси хлороформ, метанол(2:1 по объему) упаривают на роторном испарителе до образования липидной пленки. Полученную пленку липидов растворяют в 1,5 мл диэтилового эфира, добавляют 0,5 мл раствора липополисахарида (ЛПС), предварительно обработанного 0,1 й йаОН и содержащего 175 мМ кальцеина. Полученную двухфазную систему подвергают действию ультразвука в дезинтеграторе при частоте 22 кГц в течение 20-30 с. Полученную эмульсию упаривают на роторном испарителе до образования твердого геля при 35-45 КПа, а затем при 25 КПа до полного удаления эфира; Невключающийся маркер отделяют. гельфильтрацией на колонке с сефадексом 6-50. Полученный липосомальный иммунореагент сохраняется при+4 С в течение 3 - 4 месяцев без утраты своей биологической активности.П р и м е р 2. Количественное определение содержания ЛПС в сыворотке крови больного.В две пробирки вносят по 10 мкл сыворотки больного и по 20 мкл антисыворотки с разведением 1:32,Через 10 мин инкубации при комнатной температуре добавляют 40 мкл (60 нмолей липида) суспензии липосомального иммунореагента, дополнительно инкубируют 10 мин, после чего вносят 10 мкл триссолевого буфера, содержащего 5 мМ МдС 12 и 1,5 мМ СаС 12 и 20 мкл комплемента, в качестве которого используют сыворотку крови морской свинки или кролика. Объем смеси доводят до 100 мкл трис-солевым буфером. : Параллельно ставят контроли на неспецифический лизис липисом антисывороткой и исследуемой сывороткой больного в присутствии комплемента. Через 30 мин реакции останавливают 3 мл трис-солевого буфера. Флуоресценцию измеряют в кювете с длиной оптического пути 1 см или пробирке при длиНе волн эмиссии и возбуждения 493 и 520 нм соответственно.Расчет величины иммунного лиэиса проводится по уравнению (1), при этом берутся средние значения двух параллельных измерений. По калибровочной кривой определяют содержание ОПС-антигена в мкг/мл, которое для трех образцов сывороток больных сальмонеллезом составило 0,7;11,2; 29,5 мкг ЛПС/мл образца сыворотки крови больного.В табл, 1 отражены результаты определения интенсивности флуоресценции и расчет величины концентрации и процента иммунного лизиса для трех различных сывороток больных с различными содержаниямисоматического 0-антигена Яа 1 еопе 11 атурЫацг 1 цв в сыворотке крови. П р и м е р 3. Повышение воспроизводимости и точности метода,Липосомы приготовили, как указано в примере 1, определение антигена проводят, как указано в примере 2. В табл, 2 приведены значения доли иммунного лизиса и концентрации антигена, определенного с одной партией липосом в сыворотке крови больного, что отражает воспроизводимость метода,В табл. 3 приведены значения определения величин иммунного лизиса, соответствующего определенным концентрациям ЛПС-антигена в растворе, Для проведения. анализа взяты приготовленные каждый раз заново партии липосомального иммунореагента, что отражает воспроизводимость метода.П р и м е р 4. Построение калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой готовят ряд разведений стандартного раствора ЛПС Я. лурЫацгЫе в трис-солевом буфере, 10 мкл раствора ЛПС каждой концентрации смешивают с 20 мкл стандартной антисцворотки. Используют такое разведение антисыворотки, которое дает 90-60% от максимального иммунного лизиса. Определяют иммуннцй лизис в тех же условиях, что ис образцами сыворотки больного, Ставят также контроли: липосомы только с буферным раствором, липосомы только с антисывороткой, липосомы только с комплементом. За 100 принимают величину иммунного лизиса липосом в отсутствие ЛПС. Диапазон измеряемых концентраций от 0,5 до 200 мкл/ЛПС/мл исходного раствора. Строят кривую зависимости величи1120003 Таблица 1 Таблица 2 ны иммунного лизиса от логарифма концентрации ЛПС в растворе,Предложенный способ позволяет в 2-3 раза повысить точность в сравнении с известным способом, 5 Изобретением может быть использовано в практике здравоохранения для экспресс- диагностики инфекционных заболеваний и определения тяжести их протекания контро ля загрязнения окружающей среды, в научноисследовательской практике для изучения динамики антигенемии при экспериментальном инфицировании животных,Предложенный способ легко может 15 быть автоматизирован, требует малого (10 мкл) количества исследуемой сыворотки. Формула изобретения Способ определения липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови, включающий встраивание антигена в мембрану липосом, включение маркера внутрь липосом, проведение реакции комплементозависимого. лизиса с последующим определением антигена по выходумаркера, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа. липополисахариды перед встраиванием в липосомы обрабатывают 0,1 н.щелочью при нагревании до 95 С в течение 10 мин, в качестве маркера используют кальцеин, не- включившийся маркер отделяют гельфильтрацией, а выход маркера определяют флюо риметрически.1720003 Таблица 3 оставитель Н.Гуляевахред М.Моргентал Корректор М.Кучеряв Редактор И.Сегляник й комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 рои во нно-издате каэ 769 Тираж Подписное ВНИИПИ Гссударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5