Способ определения иммунопатологического состояния организма, связанного с нарушением в-клеточного звена иммунитета

ЮЗ СОВЕТСКИХЦИАЛИСТИЧЕСКИХСПУБЛИК 16 39) ъЖ. 33 5)5 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ ЕЛЬСТВ АВТОРСКОМУ СВ ммуноло СРх, В.И. Н ипе, ОтаТ. еаст 1 чав опузтеп)1 с 1аот 1-с азз8,140, М, а 1.о В. риз 1 ам3, р. ции 7-е ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт клинической ибирского отделения АМН С(56) Тапа 3 са 153)1 га 3 сачча РМес 1)ап 3 зп) о 1 зропсапеоизсев 1 п рат 1 ептз а 1 с 3) зегуйеглатозцз. Апа 1 уз 3 з юйЬобу. - 1. 1 гпп)ипо 1 о 9 у, 198761-767,Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть испол ьэова но в сложн ых диагностических случаях, а также в случаях подозрения на иммунопатологию, характерную для аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний,Целью изобретения является повышение точности диагностики,Способ осуществляют следующим образом,Иэ периферической крови обследуемых пациентов выделяют мононуклеары (МК) центрифугированием гепаринизированной венозной крови (100 ЕД гепарина на 1 мл крови) в градиенте плотности фиколла-ве 2(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА, СВЯЗАННОГО С НАРУШЕНИЕМ В-КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА(57) Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности диагностики иммунопатологических состояний, характерных для аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний. Для достижения цели мононуклеары периферической крови перед культивированием обрабатывают митомицином С и определяют уровень спонтанной секреции иммуноглобулинов по отношению к контролю. При величине остаточного синтеза иммуноглобулинов более 7судят о наличии иммунопатологического процесса. Способ эффективен в 74 случаев и позволяет повысить точность диаг- Ж ностики е среднем на 140 ь. С: рографина(плотность 1,077) при 800 9. 5 х 10 МК в среде 199, дополненной 10-ной фетальной телячьей сыворотки ,ФТС), обрабатывают митС (319 п)а) в дозе 40 мкг/мл в течение 45 мин при 37 С, Затем клетки троекратно отмывают в среде 199 и ресуспендируют в среде культуральной КРМ 1- 1640, дополненной 0,3 мг/мл 1-глютамина, 2 мМ Нерез-буфера, 100 мгк/мл гентамицина и 100 ФТС. Необработанные и обработанные митС МК (0,2 х 10 /лунку) культивируют6в круглодонных лунках планшетов лгя иммунологических исследований при 37 С в С 02-инкубаторе, Интенсивность секре иммуноглобулинов (ИГ) определяют на сутки методом иммуноферментного анали 1686365киси водорода. После инкубации в течение10 - 15 мин при комнатной температуре цветовую реакцию останавливают добавлени 50 за(ИФА), Для этого 96-луночные плоскодонные планшеты (Воуу) обрабатывают раствором бараньих антител против ) -цепей ИГ человека (10 мкг/мл) в 0,01 М карбонатном буфере (рН 8,6-9,0) в обьеме 0,1 мл/лунку в течение 4 - 5 ч при 37 С во влажной атмосфере. Далее планшеты троекратно отмывают фосфат забуференным физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2), Для предотвращения неспецифического связывания планшеты обрабатывают 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА, Вдп)а) в 0,01 М карбонатном буфере в обьеме 0,15 мл/лунку в течение 16-18 ч при 4 С во влажной камере, После этого планшеты троекратно отмывагот раствором 0,05%- ного таина (Тууееп 20, РегаК). Исследуемые культуральные супернатанты разводят 1;4 в ЗФР, содержащем 0,05% твина, перед внесением в лунки планшет для иммуноферментного анализа, Одновременно готовят калибровочные разведения эталонной сыворотки человека (от 1600 до 12 нг/мл) в аналогичном растворе, Супернатанты и эталонную сыворотку вносят в объеме 0,1 мл/лунку и инкубируют 1 - 2 ч при 37 С, Планшеты отмывают 5 раз 0,05%-ным раствором твина, Далее в лунки вносят конъюгированные с пероксидазой хрена антитела против :цепей ИГ человека (0,1 мл/лунку) в разведении 1:750, Инкубацию проводят при 37 С в течение 1 - 2 ч, после чего планшеты отмывают 10 раз 0,05 о(т-ным раствором твина. Ферментативную активность пероксидазы в образовавшихся комплексах определяют добавлением в лунки по 0,1 мл субстратного раствора, приготовленного следующим образом: 1,2-фенилдиамин (10 мг на 1 мл метипового спирта) разводят в 0,05.М цитратном буфере (рН 4,6 в соотношении 1:99 и к 100 мл указанной смеси добавляют 0,01 мл 33%-ного раствора переем в лУнки по 0,05 мл 50 о/о-ной сеРнай кислоты. Фотометрию проводят на аппарате Мультискан (Нов) при длине волны 472 нм, Концентрацию ИГ (нг/мл) определяют, откладывая среднее значение оптической плотности из трех идентичных образцов на прямом отрезке калибровочной кривой,О наличии иммунопатологического состояния судят по величине остаточного ИГ- синтеза, рассчитанной по формуле ИГ-синтез (нт/мл) в культурах митс. обработанных МК ИГ.синтез(нгlмл в культурах МК, необработанных митс 5 10 15 20 25 30 35 40 При величине более 7% судят о наличии активированных В-лимфоцитов, характерных для иммунопатологического процесса.П р и м е р 1. Больной Г., 27 лет, поступил в нефрологическое отделение, При поступлении жалоб не предъявлял. Иэ анамнеза в июле 1987 г. больной перенес глубокий термический ожог левого предплечья с последующей кожной пластикой, В августе 1987 г, впервые отметил рецидивирующие макрогематурии, появление которых связывает с переохлаждением. Направлен на обследование.При обьективном исследовании патологических изменений со стороны внутренних органов не отмечено. В общем анализе крови регистрировалось умеренное увеличение СОЭ: Эр 4,27 х 1012/л; Гем 147 г/л; Лейк 6,6 х 109/л; СОЭ 16 мм/ч. Мочевина крови 4,66 ммоль/л; СРБ О; холестерин 4,68 ммоль/л; Р-липопротеиды 4700 мг/л; белок крови 68,3 г/л, Белковые фракции; альбумины 62%; глобулины - а 1 4 о/о, а 2 5% ф 11;(,.у 18 о(з, Креатинин крови 0,105 ммоль/л, клубочковая фильтрация 127 мл/мин, реабсорбция 99,0%, Количественное определение форменных элементов в моче пробой Нечипоренко: Лейк 1000/мл; Эр 0; цилиндры 0; суточная протеинурия - следы. Ультразвуковое исследование почек (эхография), цистоскопия патологических изменений не выявили.Проведенные клиника-лабораторные исследования (лишь умеренное увеличение СОЭ) не позволяли судить о течении какого- либо иммунопатологического процесса в почках, Складывалось впечатление о наличии в анамнезе транэиторной гематурии, обусловленной алиментарными факторами. Однако, иммунологическое исследование по предлагаемому способу выя вило, что уро,вень спонтанной ИГ-секреции в культуре МК, необработанных митС, составил 4700 нг/мл, а в культуре МК, обработанных митС, - 500 нг/мл, Уровень остаточного ИГ-синтеза равен 10,6%. Следовательно, среди лимфоцитов периферической крови пациента присутствуют активированные В-клетки, способные секретировать ИГ без пролиферации, что является характерным признаком иммунопатологического состояния,При проведенном впоследствии гистологическом исследовании почечного биоптата был установлен диагноз хронического, мезангиопролиферативного гломерулонефрита, Окончательный клинический диагноз: хронический гломерулонефрит, гематурическая форма, мезангиопролиферативный вариант.П р и м е р 2. В онкологический диспансер была направлена на консультацию амбулаторная больная Л., 33 года, с диагнозом: лимфоаденопатия неясного генезэ,Больная предъявляла жалобы на повышенную утомляемость и на увеличение шейных лимфоузлов. Две недели назад(начало сентября 1987 г,) почувствовала недомогание: сухой кашель, подъем температуры до 37,4 С, потливость. Участковым терапевтом был поставлен диагноз: острое респираторное заболевание и назначена адекватная терапия. Через 7 дней симптомы воспаления были купированы, однако сохранялась общая слабость и повышенная утомляемость. Объективно выявлялись увеличенные(1,5 - 2,0 см), плотные, безболезненные, подвижные лимфоузлы. В общем анализе крови: Эр 4,6 х 10 /л; Гем 146 г/л; Лейк 6,8 х 10 /л; СОЭ 12 мм/ч. Других патологических симптомов не обнаружено. Для уточнения диагноза больная была направлена на консультацию в онкодиспэнсер.Из данных объективного и лабораторного обследований четкого представления о характере заболевания не складывалось. Увеличение лимфоуэлов могло отражать реакцию организма на предшествующее воспаление (ОРЗ), могло быть проявлением лимфолейкоза (но нормальный общий анализ крови исключал данное предположение) и, наконец, увеличение лимфоузлов могло быть в результате матастазирования какой- либо злокачественной опухоли. Дифференциальная диагностика вызывала затруднения.Проведенное иммунологическое обследование по предлагаемому способу показало, что уровень спонтанной секреции ИГ в культурах интактных МК составил 1100 нг/мл, а после обработки из митС 425 нг/мл. Таким образом, уровень остаточной ИГ-секреции равен 38,6%. Следовательно, среди лимфоцитов периферической крови больной Л, присутствуют активированные В-клетки, способные секретировать ИГ без пролиферации, что свидетельствует о наличии иммунопатологического состояния, вероятнее всего, лимфопролиферативного генеза.Проведенная впоследствии биопсия лимфоузла подтвердила данное предположение,Окончательный диагноз: лимфосаркомалимфатических узлов, нодулярная форма,5 П р и м е р 3. Больному О., 26 лет, послепрохождения профилактического осмотра вполиклинике был выставлен диагноз; хрони ческий тонзиллит, компенсированная форма, гипертрофия миндалин И степени и для10 исключения различных осложнений (в томчисле аутоиммунных) было рекомендованорасширенное лабораторное обследование,Иммунологическое исследование по предлагаемому способу показало, что уровень15 спонтанной секреции ИГ в культурах интактных МК составил 2520 нг/мл, а в культуремитС-обработанных МК - 45 нг/мл, Уровеньостаточного ИГ-синтеза равен 1,8. Такимобразом, при неспецифических воспалитель 20 ных заболеваниях среди циркулирующихлимфоцитов отсутствуют активированные Вклетки, способные секретировать ИГ без пролиферации, и у данного пациента нетиммунопатологии, ассоциированной с ауто 25 иммунными или лимфопролиферативнымизаболеваниями,Способ позволяет выявить наличие иммунопатологического состояния при отсутствиидостаточных клинико-лабораторных данных30 и позволяет повысить точность диагностикив среднем на 140 ,формула изобретения Способ определения иммунопатологи ческого состояния организма, связанного снарушением В-кпеточного звена иммунитета, путем оценки уровня спонтанной секреции иммуноглобулинов в культуре интактных мононуклеаров периферической 40 крови,отличающийся тем,что,сцельюповышения точности способа, перед культивированием пробу с мононуклеарами обрабатывают митомицином С и при уровне остаточной секреции иммуноглобупинов более 7 % по 45 сравнению с пробой без митомицина определяют наличие иммунопатологического состояния,1686365 Составитель Р,ГуменюкТехред М,Моргентал Корректор М.Кучерявая Редактор И.Дербак Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 3595 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5