Способ определения клеточного иммунитета

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5 0 01 й ЗЗ/5 ТЕНИ исследовательскии ство СССР00, 23.08,85.НИЯ КЛЕТОЧНОтся к ветеринарии, чнее к разделу клежет быть использоГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЗО ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Украинский научноветеринарный институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛГО ИММУНИТЕТА(57) Изобретение относмедицине и биологии, тоточной иммунологии, и м Изобретение относится к медицине, ветеринарии и биологии, разделу клеточной иммунологии и может быть использовано для определения клеточного иммунитета организма в клинических и научно-исследовательских медицинских и ветеринарных лабораториях,Целью изобретения является повышение точности и сокращение времени определения.Способ осуществляют следующим образом. Отбирают пробу крови объемом 1-2 мл с добавлением 8-10 ед, гепарина на 1 мл крови. Кровь отстаивают при комнатной температуре 0,5-1,0 ч, отбирают слой лейкоцитов с плазмой, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при 800 об/мин, Плазму крови отсасывают, а из осадка лейкоцитов готовят суспензию, содержащую 1,5 х 10 - 2,0 х 10 клеток в 1 мл питаб бтельной среды,Суспенэию лейкоцитов наносят нэ обезжиренное стекло в виде капель и помещают во влажную камеру, Лейкоциты инкубируат вано для характеристики состояния клеточного иммунитета организма в ветеринарных и медицинских лабораториях иммунологического профиля. Цель - повышение точности и сокращение времени исследования, Цель достигается введением в суспензию лейкоцитов за 30-40 мин до окончания культивирования взвеси инактивированных стафилококков из расчета 150-200 млн микробных тел на 1 мл суспензии лейкоцитов с дополнительной оценкой клеточного иммунитета по фэгоцитарной активности лейкоцитов и количеству бластов в одном препарате. 2 табл,при 4-8 С в течение 1-2 ч. За 30-40 мин ро окончания инкубации в суспензию лейкоцитов вносят взвесь инактивированных стафилококков иэ расчета 150-200 млн. микробных тел на 1 мл суспензии клеток, По окончании инкубации стекла вынимают из камеры, спо- ласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают по Паппенгейму. Клеточный иммунитет определяют путем микроскопирования 100- . 200 мононуклеарных лейкоцитов и подсчета среди них числа бластных клеток лимфоидной природы и нелимфоидной (по размерам, :оотношению ядра и цитоплазмы, конденсации хроматина ядра) и определения в этих же клетках на тех же препаратах показателей фагоцитарной активности по поглощению ими инактивированных стафилококков,Результаты оеакции учитывают в следующих показателях.Относительное содержание трансформированных лимфоцитовВ х 100В+Сгде А - показатель трансформированныхлимфоцитов, ,ь;Вколичество трасформированныхлимфоцитов;С - количество нетрансформированных 5лимфоцитов,Относительное содержание трансформированных клеток нелимфоидной природыЕ х 100 ОЕ+К 10где Д - показатель трансформированныхнелимфоидных клеток, %;Е - количество нелимфоидных трансформированных клеток;К - количество нетрансформированных 15клеток,Фагоцитарный показательТх 100 оТ+Ргде Н - фагоцитарный показатель, О, 20Т - количество фагоцитирующих мононуклеарных лейкоцитов;Р - количество нефагоцитирующих мононуклеарных лейкоцитов,Фагоцитарное число 25ЛФ = -Мгде Ф - фагоцитарное число;Л - количество поглощенных кокков;М - количество мононуклеарных лейкоцитов, в которых подсчитывали поглощенные кокки.Число трансформированных лимфоцитов у здоровых людей 41 О трансформированных клеток нелимфоидной природы 3522,ь, фагоцитарный показатель 63 оь, фагоцитарное число 8,Учет реакции по бластной трансформации клеток и их фагоцитарной активностипрост, удобен, доступен лабораторному работнику средней квалификации, Бластныеклетки легко идентифицируются ввиду ихкрупных размеров (в 2-4 раза больше лимфоцитов), отчетливого увеличения площадицитоплазмы, преобладания в ядре нежного 45зухроматина ярко - розового скрашивания,Полученные результаты обрабатываютстатистически. Для этого удобен метод Монцевичуте - Эринге че.П р и м е р 1, Определение клеточного 50иммунитета больных хронической пневмонией.На стационарном лечении находилось12 больных в возрасте 29-52 лет с диагнозом; хроническая рецидивирующая пневмония, пневмосклероз, Диагноз установлен наосновании анамнестических аускультативных, рентгенологических данных и результатах функциональной диагностики,В результате и роведен ного лечения через 24-31 день состояние у всех больных улучшилось и они в удовлетворительном состоянии были выписаны из стационара, Субъективное улучшение сопровождалось улучшением аускультативной, рентгенологической симптоматики и функциональных проб.При поступлении и перед выпиской у больных отбирали пробы крови и проводили определение клеточного иммунитета согласно предложенному способу.Для этого у больных отбирали кровь из локтевой вены в объеме 2 мл в обработанные гепарином пробирки, отстаивали 40 мин, переносили взвесь лейкоцитов в центрифужную пробирку и центрифугировали 20 мин при 800 об /мин, Плазму отсасывали, а к лейкоцитам добавляли питательную среду до конечной концентрации 2,0 х 10 клеток в 1 мл суспензии,Суспензию клеток наносили в виде капель на предметные стекла, помещали вовлажную камеру и инкубировали при 4 С 2 ч,За 40 мин до окончания инкубации в тех же препаратах к каждойкэпле суспензии клеток добавляли равные по обьему капли взвеси инактивировэнных стэфилококков (150 млн. микробных тел в 1 мл). По завершении инкубации стекла вынимали из камер, споласкивали дистиллированной водой, подсушивали. фиксировали 10 мин в метаноле и окрашивали по Паппенгейму, После подсчета 100-200 клеток в каждом препарате определяли количество трансформированных лимфоцитов, трансформированных клеток нелимфоидной природы и в этих же клетках - показатели их фэгоцитарной активности, Результаты исследований представлены в табл, 1,Из приведенных е табл. 1 данных следует, что определенный по предлагаемому способу уровень клеточного иммунитета коррелирует с изменением клинического состояния больных. Повышение трансформационной и фагоцитэрной активности при выписке свидетельствует о нормализации подавленной клеточной иммунологической реактивности больных хронической пневмонией и сопровождается улучшением их общего состояния, аускультативных и рентгенологических данных. Определение клеточного иммунитета согласно предлагаемому способу по трансформационным и фагоцитарным показателям в одном препарате позволяет более точно, статистически достоверно установить различия клеточного иммунитета, в то время как по известному способу выявленные различия статистически недостоверны. Кроме того, значительно сокращается продолжительность исследований, так как определение клеточного иммунитета по фагоцитарной активности согласно известному способу требует 4-5 ч, а по предлагаемому способу - 30-40 мин.П р и м е р 2, Определение клеточногоиммунитета, заболеваемости и сохранностипоросят различных пород,Определяли клеточный иммунитету 20 дневных поросят пород "ландрас" и "крупная белая" в животноводческом хозяйствепромышленного типа, С этой целью животных каждой породы объединяли в группы(по 30 голов в каждой) и проводили определение клеточного иммунитета согласно. предлагаемому способу, а также регистрировали их заболеваемость и сохранность втечение последующих 30 дней наблюдений,Для определения клеточного иммунитета у всех животных отбирали из ушных венпо 5 мл крови с гепарином и готовили взвесилейкоцитов содержащие 2,0 х 10 клеток вб1 мл; Взвести флейкоцитов наносили на отдельные предметные стекла в виде капель ипомещали во влажную камеру. Лейкоцитыинкубировали при 4"С в течение 2 ч. За 30мин до окончания инкубации к каждой каплеклеточной суспензии добавляли равные пообъему капли взвеси инактивированных стафилококков, содержавшей 200 млн, микробных тел в 1 мл, По завершении инкубациистекла вынимали из камеры, споласкивалидистиллированной водой, подсушивали,фиксировали 5 мин. в метаноле и окрашивали по Паппенгейму. При микроскопическомисследовании 100 клеток в каждом препарате подсчитывали количество трансформированных лимфоцитов, трансформированныхклеток нелимфоидной природы, а также вэтих клетках определяли фагоцитарный показатель и фагоцитарное число (см, табл, 2).Заболеваемость и сохранность поросят определяли путем ежедневных клиническихнаблюдений.Из представленных в табл, 2 данныхследует, что уровень клеточного иммунитета, определен н ый согласно и редлагаемомуспособу, статистически достоверно выше упоросят породы "ландрас", Дальнейшие наблюдения за животными показали, что у этихже поросят на 12 ниже заболеваемость и на3,3 выше сохранность. Это указывает навысокую точность определения у них клеточного иммунитета и возможность прогнозирования по этим показателям ущерба отзаболеваемости. Расчетный экономическийэффект определения клеточного иммунитета по предлагаемому способу составил А=В- С,где А - расчетный экономический эффект;В - стоимость прогнозируемого ущерба(4 головы х 12,0 кг х 2,5 руб,);5 С - затраты на проведение исследованийА = 4 гол. х 12,0 кг х 2,5 руб, - 10 руб, - .4 10 руб. или 36,6 тыс. руб, в год в хозяйствена 800 основных свиноматок.10 Следует отметить, что определение вданном примере клеточного иммунитетатолько по бластным клеткам (как это предлагает известное техническое решение) не обеспечивает получения статистически достоверных15 данных и не определяет клеточный иммунитет с необходимой для прогнозирования заболеваемости и ущерба точностью.Таким образом, по сравнению с известным, предложенный способ позволяет в бо 20 лее короткие сроки (2 ч, а по известномуспособу только определение фагоцитарнойактивности требует 4-5 ч и с более высокойточностью определить состояние клеточногоиммунитета. Его использование позволяет25 избежать ошибок в оценке клеточного иммунитета у больных с инфекционными и другими заболеваниями, при проведении у нихлечебных мероприятий. Предлагаемый способ более точно устанавливает клеточный30 иммунитет у животных, что позволяет повысить экономический эффект и результативность исследований по отбору животных свысокой устойчивостью к заболеваниям.Способ технологически не сложен, не35 требует дефицитных или импортных реактивов и оборудования и может быть использованв медицинских и ветеринарных лабораториях в качестве экспресс-метода диагностикии прогнозирования заболеваний человека и40 животных,Формула изобретения Способ определения клеточного иммунитета, включающий выделение лейкоцитов из 45 крови, культивирование их на предметныхстеклах и подсчет бластных клеток, отл и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени определения, к суспензии лейкоцитов добавляют взвесь 50 инактиаированного стафилококка, при этомвносят его в количестве 150-200 млн микробных тел на 1 мл суспензии за 30-40 мин до окончания культивирования и дополнительно определяют фагоцитарную активность 55 лейкоцитов в том же препарате,1686364 Таблица 1 Показатели клеточного иммунитета больных хронической пневмонией,05 а 2 Показатели клеточного иммунитета, заболеваемости и сохранности поросят различныхрод ты 4+ Составитель Г. КрюковаТехред М. Моргентал Корректор М, Дечик едактор Л, Лашков Заказ 3594 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям и113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 1