Способ определения содержания сфингомиелина в биологических жидкостях

(51)5 6 01 й 33/68 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РСФСР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СФИНГОМИЕЛИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ(57) Изобретение относится к биологической химии и медицине, Цель изобретеИзобретение относится к биологической химии, а именно к способам определения концентрации фосфолипида сфингомиелина, и может быть использовано для,антенатальной диагностики развития респираторного дистресс-синдрома (РДС) у новорожденных, когда для определения степени зрелости легких плода измеряется отношение Лецитин (сфингомиелин или глицерофосфатиды) - сфингомиелин в амниотической жидкости, Кроме того, способ может быть использован в биохимических исследованиях, связанных с диагностикой и патогенезом различных нарушений липидного обмена,Цель изобретения -упрощение способапри массовых анализах за счет сокращениястадий, Ы 1663554 А 1 ния - упрощение способа, Цел ь достигается гидролизом упаренного липидного экстракта 0,1 - 0,2 н,йаОНв метаноле в течение 0,5 - 4 ч, удалейием продуктов гидролиза путем встряхивания с водой и хлороформом с последующим измерением содержания сфингомиелина, Сравнение способа со способом двухмерной тонкослойной хроматографии показало его высокую точность - 98 - 99;4 Способ позволяет проводить определение уровня сфингомиелина без использования дорогостоящего оборудования и реактивов, что дает возможность использования его как вбиохимической практике, так и в медицине при диагностике респираторного дистресс-синдрома новорожденных.5 табл,Цель достигается тем, что упаренный в вакууме липидный экстракт, соответствующий 0,5 мл сыворотки крови или 1,5 мл амниотической жидкости подвергают мягкому О щелочному гидролизу 0,1-0,2 н,йаОН в ме С таноле в течение 0,5 - 4,0 ч, посйе чего про- (дукты гидролиза разделяют путем,встряхивания в смеси с водой с хлорофор- у мом с последующим отстаиванием. При, р этом в водную фазу уходят продукты гидро- лиза глицерофосфатидов, а устойчивый к щелочному гидролизу сфингомиелин остается в нижней органической фазе. После - д разделения фаз количество сфингомиелина определяют с помощью любого метода определения фосфолипидов. Упаривание липидного экстракта осуществляют в вакууме при 40-50 С, гидролиз проводят при концентрации МаОН ( 0,1 - 0,2 н, вместо 1 н.в известном способе), при несколько большейтемпературе, 42 - 48 С, Для разделения продуктов гидролиза используют хлороформы - метанол - вода в соотношении(2;1;0,6).П р и м е р 1. Определение содержаниясфингомиелина в амниотической жидкости,1,5 мл амниотической жидкости помещаютв три обьема смеси хлороформ:метанол (2:1)и экстрагируют липиды, Экстракт липидовконцентрируют путем упаривания в вакууме при 45 С (на роторном испарителе или вколбе с нисходя;цим холодильником) или вширокой пробирке на водяной бане при50 - 60 С небольшими порциями, затем переносят в пробирки, снабженные завинчивающимися крышками с прокладками типа"Ругех" США и быстро упаривают досуха наводяной бане(гидролиз можно проводить вколбе с обратным холодильником),Осадок липидов растворяют в 2,0 млметанола, добавляют 0,2 мл 1 н. водногоМаОН и инкубируют на водяной бане при45 С 2 ч с периодическим встряхиванием,После гидролиза в пробирку добавляют 4 млхлороформа и 1,2 мл воды (соотношениехлороформ:метанол:вода взято согласноФолчу), пробирку энергично встряхивают ипосле отстаивания отделяют нижнюю фазу.Параллельно равные аликвоты липидного экстракта используют для определения сфингомиелина по известному способу,а также при помощи ТСХ (прототип).Для проверки полноты гидролиза глицерофосфатидов после гидролиза по предлагаемому способу из содержащейсфингомиелин нижней фазы следовые количества (2 - 3 мкл) наносят на пластинку с тонким слоем силикагеля и хроматографируютв системе хлороформ:метанол:вода 65:25:4,При этом экстракт после гидролиза по предлагаемому методу содержит только однопятно сфингомиелина, в то время как послегидролиза по известному способу над пятном сфингомиелина было отчетливое пятнолецитина; составляющее до 50; от исходного его содержания. Это указывало на неполное расщепление лецитина в процессегидролиза в условиях известного способа,Для определения количества непрогидролизовавшихся фосфолипидов,нижнююЬазч после гидролиза согласно обоим способам переносят количественно в огнеупорныепробирки, упаривают растворитель досухана водяной бане и определяют содержаниефосфолипидов, Параллельно проводят тоже определение для содержащей сфингомиелин эоны силикагеля после ТСХ,Результаты приведены в табл. 1.Как видно иэ табл. 1, результаты определения сфингомиелина согласно предлага 5 10,ся фосфолипиды, как в примере 1, с параллельным определением сфингомиели на обычным методом с использованием ТСХ обобщены в табл. 4 55 40 45 50 емому способу почти совпадают с полученными при помощи классического способа с использованием ТСХ (расхождение 2 - 5;, в то время как определение согласно известному способу дает грубое завышение (в 1,2 - 2,2 раза) за счет неполного гидролиза глицерофосфатидов.С целью расчета точности предлагаемого способа проводят опредение сфингомиелина согласно этому способу в амниотической жидкости 55 женщин при сроке беременности 28 - 40 нед.Результаты приведены в табл. 2.Приведенные результаты статистически подтверждают отсутствие различий в определении сфингомиелина с. помощью точного, но громоздкого метода, использующего ТСХ, и предлагаемого гидролитического способа.П р и м е р 2. Определение содержания сфингомиелина в сыворотке крови.0,05 мл сыворотки крови добавляют к 10 мл хлороформа-метанола (2:1) и экстрагируют липиды. Экстракт упаривают, подвергают гидролизу и определяют непрогидролизовавшие Резул ьтаты и ри в еде н ы в табл, 3. Как видно из табл, 3, результаты определения содержания сфингомиелина в сыворотке крови по предлагаемому способу хорошо воспроизводимы и совпадают с полученными по классическому способу с использованием ТСХ. Таким образом, предлагаемый способ пригоден для определения содержания сфингомиелина и в сыворотке крови,П р и м е р 3. Изменение условий гидролиза.Из 0,5 мл сыворотки крови с известным содержанием сфингомиелина (49 мг/дл), определенным предварительно с помощью ТСХ, экстрагируют липиды и обрабатывают экстракт, как в примере 1. Гидролиэ.осуществляют, изменяя концентрацию ИаОН, время и температуру, после чего в каждом случае проводят обработку реакционной смеси, как в примере 1, с последующим определением непрогидролизовавшихся фосфолипидов известным методом. Результаты Из табл. 4 видно, что правильные результаты, т,е, близкие к результатам, полученным при помощи ТСХ, удается получить при использовании концентрации щелочи в процессе гидролиза не ниже 0,1 н, а температуры гидролиза не ниже 42 С и не выше1663554 Таким образом, предлагаемый способпозволяет проводить определение уровня сфингомиелина с помощью мягкого щелоч ного гидролиза в отработанных условиях нетолько в амниотической жидкости, но также и в сыворотке крови и, возможно, в других биологических препаратах. Метод информативен и точен, в сочетании с простотой вы полнения не требует дорогостоящегооборудования и реактивов, что создает возможность для широкого внедрения его в повседневную клиническую практику, в частности для антенатального определения 15 степени зрелости легких плода и прогнозирования развития респираторного дистресс-синдрома у новорожденных. Формула изобретения 20 Способ определения содержания сфингомиелина в биологических жидкостях путем экстракции липигов хлороформ-метанольной смесью, вакуумного упаривания экстракта, растворения его в органическом 25 растворителе с последующим фракционированием и измерением, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью упрощения способа при массовых анализах за счет сокращения стадий, экстракт растворяют в метаноле, до бавляют к нему 0,1 - 0,2 н.КаОН и инкубиоуют 05 4 ч при 42 48 С, затем полученному гидролизату липидов добавляют хлороформ и воду при обьемном соотношении хлороформ:метанол в гидро лизате:вода 2:1:0,6, смесь встряхивают, отбирают нижнюю фазу с последующим нанесением пробы на пластину и измерением. Таблица 1 Концентрация сфингомиелина в амниотической жидкости, / е нная и тем005 48 С. При более низких значениях концентрации МаОН и температуры (опыты 1 и 8) гидролиз глицерофосфатидов неполный, что проявляется в завышении результата определения сфингомиелина. При превышении указанного значения температуры (опыт 12), напротив, результаты занижены вследствие частичного разложения сфингомиелина (СФ).П р и м е р 4. Изменение условий гидролиза.амниотической жидкости.1,5 мл амниотической жидкости зкстрагируют, как в примере 1, Проводят гйдролиз упаренного экстракта липидов, согласно примеру 1 при 15 С, меняя время гидролиза и повышая концентрацию ЙаОН. Результаты определения непрогидролизовавшихся фосфолипидов приведены в.табл, 5.Как видно из табл. 5, количество непрогидролиэовавшихся фосфатидов соответствует содержанию сфингомиелина при концентрации ИаОН не ниже 0,1 и не выше 0,2 н. При более низкой концентрации МаОН (в более мягких условиях опыт 1) результаты завышены вследствие неполного гидролиза, а при более выооких занижены (опыт 4) ввиду некоторого разрушения сфингомиелина,В отношении времени гидролиза иэ табл. 5 видно, что верные результаты получаются при продолжительности опыта от 0,5 до 4 ч. Увеличение продолжительности гидролиза свыше 5 ч и уменьшение времени (0,5 ч и ниже) также приводят к искажению результатов или ввиду неполного гидролиза (опыт 5) или вследствие некоторого разрушения определяемого вещества - сфингомиелина (опыт 14). 0,1 н. ИаОН, 2 1 н, ИаОН, 15,ч, 45 С (пред-,минут, 37 Слагаемый ) прототип ) Ошибка по сравнению с ТСХ, (,1663554 абл М образца амниотической жидкости Концентрация непрогидКлнечн он цент ия ИаО ремя,Истинная концентрация СФ, определен ная путем ТСХ, мг/л яра- Н,ролизовавшихся фосфолипидов (СФ ), мг/л 2 10,7 Б3 12,3 0,20,51 12,5 12,5 12,5 12,3 12,3 15,2 15,2 15 15 15 5,7 4 12 13 5,8 5,8 0,1 ь А, АгуреевМоргентал. Корректор Т. Пали СоставиСпесивых Техред Редактор аказ 2264 Тираж 418 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 роизводственно-издательск 0,05 0,1 0,2 0,4 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1% концентра ции непрогидрол и зо Вд В шихся фосфолипидов отистинной концентраии СФ 109,1 97,3 97,345,5 268,0 101,6 101 6 101,6 98,7 98,7 98,7 98,7 98,3 68,9 омбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина. 101