Способ определения численности углеводородокисляющих бактерий

(21) (22) (46) 9 7 л фильтр ы Зеи ится к санитарной т быть использо" ического аналиво и особенно Переово бретение отно чени вание ворон ным с кробиологии и можно для бактериол моченв пламени гос максиего обрае ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР САНИЕ И ОБ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕПЬСТ(71) Днепропетровский государственный университет им. 300-летия воссоеди - цения Украины с Россией(56) Руководство по методам анализа морской воды и донных отложений . - Л,: Гидрометеоиздат, 1980, с. 56-60ЬсгазМгаЬоча Ч. ИеСЬодз Гог соцпС 1 п 9 иэйег ЬасСег 1 а-сошрэг 1 зоп апс 1 з 19 п 111 сапсе, - Ас 1 а 1 уагос 61 в., пус 1 гс Ьо 1., 1973, ч. 1, Р 5, р. 433 - 454. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕ 1 ИЯ ЧИСЛЕННОСТИ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к санитарной микробиологии и может быть исэа природных сточных ддонных отложений.Целью изобретения является повышение точности способа.Способ за ключается в следукщем.едовательных разве10 , 1010Есают воду, то к разо не прибегать. Из отфильтровывают воды через мемаметром пор 0,2- едварительно кипя"иной воде до 10 раэ токлаве при 1,2 атм Готовят ряд посл дений пробы грунта ли анализу подверг ведению пробы можн каждого разведения определенный объем бранный фильтр с ди 0,3 мкм. Фильтры пр тят в дистиллирова и стерилиэуют в ав пользовано для бактериологического анализа природных сточных вод, а именно донных отложений. Целью изобретения является повышение точности способа, Способ заключается в фильтровании через мембранный фильтр пробыводы или разведений водной вытяжки из грунта, нанесении на фильтрующую поверхность фильтра тонкого слоя углеводорода или их смеси, размещении фильтра на пористой подложке, увлажненной минеральной средой, и культивировании при 20-21 С. Учет микроколоний на фильтре ведут под микроскопом после 2-3 и 5-6 суток культивирования, что позволяет дифференцирован- сФ но учитыв ат ь б актерии, спо с об ные к активному и медленному окислению угеводородов. 1 табл. м разведении н ику протирают тампопиртом, и обжигаютелки. Фильтровать начиального р аз ведения, по ботку воронки спиртом для последующих разведений не производят,Фильтры фильтрующей поверхностью погружают на 2-3 с в капельки стерил ной нефти, нанесенные на дно чашки Петри. Для каждого фильтра желательно использовать отдельную каплю нефти. Далее их переносят на пористую поверхность подложки, в качестве кот рой можно применять поролон. Подложки толщиной 5 мм подготавливают к работе аналогично фильтрам (кипятятдо 10 раэ и стерилизуют при 1,2 атмв течение 40 мин), после чего помещают на дно стерильной чашки Петри,в которую заливают минерапьную среду,например среду Диановой-Ворошиловой,В одной чашке можно расположить до3-4 подложек и, соответственно, Фильтров,Посевы инкубируют при 21 оС, Учетвыросших колоний производят под микроскопом при увеличении 120 раэ 8 х1, 510) в 10 полях зрения с последукщим пересчетом на 1 мл исходнойпробы. Колонии контрастно выделяютсяна Фо не нефтепродукта, что поэ воляет избегать окрашивания Фильтра зритрозином, сохраняя живыми культурымикро ор ганиз мов.Расчет численности углеводородокисляющих бактерий проводят при подсчете колоний на всех Фильтрах, усредняя полученные значения, либо поодному из Фильтров при сливном ростеили, наоборот, низкой концентрации 25колоний на других Фильтрах.Появление колоний на фильтре отмечается через 2-3 сут;Учет колоний на фильтрах в процессе инкубирования приведен в табли це.Бактерии, которые в естественнойсреде адаптированы к использованиюуглеводородов в качестве субстратат,е, имеющие соответствующую фермент ную систему, опережают по темпам роста бактерии, вынужденные синтезировать соответствующую ферментную системуАктивные углеводородокисляющиебактерии формируют колонии через 2- 403 сут, тогда как бактерии, потенциально способные утилизировать углеводороды, завершают формирование колоний через 5-6 сут,П р и м е р, 1 мл пробы воды профильтровывают через мембранный Фильтрс диаметром пор 0,2-0,3 мкм. Фильтрпредварительно кипятят в дистиллированной воде и стерилизуют в автоклаве лри 1,2 атм в течение 40 мин.После окончания фильтрования пробы мембранный фильтр фильтрукщей поверхностью погружают на 2-3 с в капельку стерильной нефти, нанесеннуюна дно чашки Петри. Далее фильтр переносят на пористую поверхность подложки толщиной 5 мм, в качестве которой используют поролон. Подложку, подготовленную так же, как и фильтр, помещают на дно чашки Петри, в которуюзапивают минеральную среду следукщего состава, г/л: КМОз 2,0; КНРО0,6; МаНРО 12 НО 1,4; Ид 50 а 7 НО0,8 МПВО,фЙНО 0,1, Ге 50 ф 7 НО следы, вода водопроводная, рН 6,9-7,2.Чашки Петри инкубируют при 21 С,Выросшие на фильтре микроколонии подсчитывают под микроскопом при увеличении 120 раэ в 1 О полях зрения с последукщим пересчетом на 1 мп исходнойпробы,После 2 сут инкубирования количество выросших микроколоний на фильтре соответствует 7,1 ф 10 клеток/мп,после 6 сут. - 59,1 ф 10Предлагаемый способ позволяет проводить учет численности активной ипотенциальной углеводород-окисляющеймикрофлоры, при этом сохраняется жизнеспособность культур микроорганизмов,вследствие контрастирования:. колонийна Фильтре углеводородным субстратом,а не химическим красителем,Формула изобретенияСпособ определения численности углеводородокислякщих. бактерий, предусматривающий фильтрацию через мембранный фильтр пробы воды или разведенийводной вытяжки из грунта, размещениефильтра на увлажненной пористой г одложке, инкубирование и учет выросшихмикроколоний под микроскопом через определенное время, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, подложку предварительно увлажняют минеральной средой, ана Фильтрукщую поверхность фильтрананосят тонкий спой углеводородногосубстрата, при этом после 2-3 сутокинкубирования проводят учет бактерий,активно окисляющих углеводороды, апосле 5-6 суток - медленно окисляющих углеводороды,219,0 7,П р и м е ч, а М и е,"-" - отсутствие роста или регистрации результата,Составитель Л. МинееваТехред А,Кравчук Редактор Н. Гунько Корректор И. Муска Заказ 4 О Тираж 362 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР3035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Щ 1 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина,О