Способ получения гриппозной вакцины

, фиыйОтЕА к поручениюатов, а имен СВ СЛ аь,ся по вы зных вак ОН Н й ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОЬРЕТЕНИЯМ И ОТНЮТИЛПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗК ПАТЕНТУ(71) Нэшнл институт оф Хелт,Даити сеяку Ко Лтд и Джуридиклфаундейшн дзе кемо серотерапеутикри серч институт (1 Р ), (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРИ 1 П 1 ОЗНОЙ. (57) Изобретение относится к получе Изобретение относитсяпрофилактических препарно гриппозных вакцин.Целью изобретения являшение иммуногенности грипцинвПримержирные сложные эда формулы 1Используют высшиефиры мур амилдипепти ЮНСОСН СН СНСО - А- тоИп3 е 11 - остаток синтетической высше нию профилактических препаратов, аточнее к способу получения гриппозныхвакцин Целью изобретения являетсяповышение иммуногенности гриппозныхвакцин Указанная цель достигаетсяпутем создания комплекса гемагглютинин-нейтраминидазамурамилдипептидноепроизводное, Данный комплекс получают при смешивании гемагглютиыигнейтрамннидазного комплекса со смесью дметилпептидных производных ввиде сложных эфиров с веществами,выбранными из группы; лецитин, холестерин, дицетилфосфат или их смеси,Затем проводят солюбилизапию полученных комплексов поверхностно-активными веществами, которые удаляютдиализом. 2 табл.жирной кислоты, имеющей в целом 20-60 углеродных атомов;А - или 1.-аланин, или Е-серии,или глицин"хаоС 1 п- изоглютамин.Возможно также использовать мурамилдипептидное производное формулы Со Н3 К - Асуп СН С-х-ХНСНСН2где Х - 1.-алании, 1.-серин, 1,-валин иглицин;У представляет собой 1111-А илиННСН(СН ) - ИНСОА,гце К - атом водорода, группа низшего алкила, карбоксимидогруппа или карбоксильная группа; и = 1-6; А - насыщенный или ненасыц 1 енный алифатический углеводородный остаток, имеющий 8 30 углеродных атомов с разветвлениями или без них.Более предпочтительный пример таК ких производных включает М в (11- эцетил мур амил-Тгал апил-из о глу т ами нил )- 11 -стеароил-Ь-лизин, называемый какИВР.уБ (1, 18)Более того предпочтительно использовать 11 - (Н-ацетилмурамил- -метил 1-алании-П-изоглу таминил)- -11 Е-стеароил Ь-,лизин, называемый какМОР- (МеАТа)-1.уЯ.Антиген гемаглютинин-нейтромиьыдаз ного кочгтлекса (НАНА) получают операциями очистки вируса гриппа посредством высокоскоростного центрифужного разделения или химической обработки аллантоисной жидкости, собраннои из яиц, зараженных вирусами гриппа, растворения очищенного вируса с неионным поверхностно-активным веществом, таким как "Тритон Х" или "ИР", или с анионным поверхностно-активным веществом, таким как дозоксихолат натрия и холат натрия, или с катионным поверхностно-активным веществом, таким как цетилтриметиламмоний, или разложения очищенного вируса с органическими растворите лями, такими как эфир, с последующей очисткой полученного препарата центрифугированием.в градиенте плотности сахарозы с помощью аффинной хроматографии или:т,п.П р и м е р .1, Вирус гриппа А (Бангкок) 1/79 (Н.М ) выращивают в оплодотворяющих куриных яйцах и очищают выращенный вирус, подвергая его высокоскоростному центрифужному разделению (23000 об,/мин, 90 мин),низкоскоростному центрифужному раз делению (6000 об./мин, 60 мин), и центрифугированию в градиенте плот ности сахарозы (30000 об,/мин, 3 ч). Затем к полученному вирусному раствору добавляют "Тритон Х" в таком количестве, чтобы конечная кон 45 50 55 Из результатов, приведенных в табл 1, видно, что все вакцины обладают лучшей способностью образования антител по сравнению со сравнительной вакциной, состоящей только из НАБА.С помощью электронного микроскопа устанавливают образование искусственных везикулоподобных частиц мурамилдипептидного производного, Они имеют те же размеры и форму, что и природнЫе частицы вируса гриппа, при чем на поверхности этих частиц анти гены НАНА связаны с мурамилдипептиднььм производным, образуя комплекс центрация "Тритона Х" стала 1%, вирус растворяют путем тщательного размешивания, после чего с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы получают очищенныйраствоп антигена НАНА, Используя полученный вьппе растворочищенного антигена НАНА, получаютописанным способом четыре вида образцов вакцины, составы которых указаны в табл,:1.Соответствующие составные частисмешивают, а затем добавляют октилглюкозид в таком количестве, чтобы конечная концентрация глюкозида стала 3 мас.%. После растворения ингредиентов осуществляют диализ в фосфатно буферный солевой раствор по из вестной методикеконцентрацию антигенаНАНА в каждом полученном таким образом образце доводят до 0,8 мкг 11/мл, а затем инокулируют их при дозе 0,5 мл/мышь в брюшину каждой из 15 мышей 01)У (самки, 4 недели). После этого мышей разделяют на три.груп пы по пять мышеи каждая и кровь со бирают из мышеи соответствующих групп через одну, две и три недели и проводят испытание ингибирования гемагглютинации, чтобы измерить спо- собность образования антитела,Мышей ПРУ также иммунизируют указанными соответствующими образцами аналогичным способом и заражают ви 35русом того штамма, который использовали для получения вакцины 2 недели спустя,. Легкие у мьппей удаляют через 4 дня, Чтобы из мерить количество ви руса в легких, проводят на легких пробу с образованием пятна клетками МОСК, Полученные результаты приведе ны в табл, 1тител, ФормСнос ула изобретенияоб получения гриппозной вак, цины, включающий заражение вирусомкуриных эмбрионов, получение вируссодержащеи алантоисной жидкости,очистку вируса гриппа и выделениеиз него гемагглютинин-нейтраминидазного комплекса, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения иммуногенности целевого продукта, дополнительно осуществпяют смешивание .гемагглютинин-нейраминидазного комплекса в массовом соотношении 1:1-100или с мурамилдипептидным производным,выбранным иэ группы веществ общей. формулы,Н 20 - О Н ОИ 5 НСОСНСН СНСО в А в Вв3Ф 5 165Для того, чтобы определить, образует ли комплекс полученный вышеобразец 1, измеряют плотности антигена НАИА всего вируса и образца 1с помощью центрифугирования в гра"диенте плотности сахарозыП р и м е р 2. Антиген НАБА готовят способом, указанным в примере 1,за исключением того, что используют,штамм гриппа А (Филиппины) 2/82 (НЫ)Антиген НАНА смешивают с ингредиен-тами, приведенными в табл,2, послечего смесь подвергают ультразвуковойобработке в теч ение 8 ми н с помощьюультразвукового излучателя,Способность образования антителкаждого полученного таким образомобразца измеряют аналогичным примеру 1 способом11 риведенные в табл.2 результатыпоказывают, что вакцины обладаютхорошей способностью образования ан 10 СОХН 2 ХН-Асуп (Н С-х-МНСНСН 32Н 2 СОгде Х - или алании, или серии, или валин, или гУ представляет Н-А или 111 НСН (СН ) - ИНСО-А,е А - насыщенный или ненасыщенный,зветвленный или неразветвленньйстаток, содержащий 8-30 атомов углерода, К- водород или алкильиая,или карбоксамидная, или карбоксиль. -ная группа, и = 1-6,или со смесью мурамилдипептидногопроизводного с холестерином в массо "вом соотношении 2:1-2, или со смесью мурамилдипептидного соединенияв массовом соотношении 1.1-20 с лецитином, или смесью лецитина с днцетилфосфатом в массовом соотношении 2-1:1 с последующим растворениемполученной смеси поверхностно-активным веществом, выбранным из группы:октипглюкозид и холат натрия, и уда-,лением поверхностно активного вещества диализом,собой Б1782 6где С 3 - остаток высшей жирной кислоты, содержащей 20 60 атомовуглерода;5А - или 1.-апаннн или Ь-се ин9Эили глнци н1 эоС 1 п -изоглютаьини общей формулы1 б 51782 Таблица 1 бр азоваСпособност61 я антителние 111) тат испытания ионной защиты мкг нач ел. 2 не) чество ру са мл О,З мкг Б (16 50 8 мкг Б 64 Нет НАБА ВЗО ИОР НАБА 0 ВЗО ИОР 50 Холестерин НАБА 0,8 мк ВЗО-ИОР 50 Лецитин 250 Дицетилфо НАБА 0,8 И 11 Р-ЬУЗ ( Лецитин 2 Днцетнлфо б Не Нет сфат 250мкг БЬ 18) 5050сфат 251 5 Нет 0) 5 (срав 1,нительный)(Бангкок) 1/24 во в 1 т ам става т 2 И Способ МК ть обрантител Н 1)нед) зования (Величи (спустя НАБА 1, ВЗО-МОР НАБА 1,0 ВЗО ЮР Лецитин Дицетилф НАБА 1,0 ВЗО"МЭР Холесте 512 0МК Б 12 сфат 5 8 мкг 102 рин 50НАБА 1,0 мкгЮР-(1.18) 30Лецитин 450ДицетилфосфатНАБА 1,0 мкгМ 1)Р-(1.18) 30Холестерин 50 9 024 50 1 О 1. (срав- нительный БА 1,(Филлипины) 2/82 во1Составитель ССв ех состлышев х дактор. Н,Ла.Палий Т ррект ед М. Дидык ко Подпис з 1 б 12 ГасуТираж 4 б 1комитета по изобрМосква, Ж, Рауш ЗаВНИИПИ ГКНТ ССС ениям и открытиям кая наб., д. 4/5 твенно 11303 Производственно-издательский комбинат "Патент",город, ул. Гагарина,