Способ получения дефектных интерферирующих частиц вируса гриппа

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИН 19) (11) ТЕНИ АВТО(2 (4 (7 тел иде рс В.В.ии-692 ТНЫХРИППАку щююЧююат титр юаемютае Фг,)/) /4 т ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ОПИСАНИЕ ИЗ ОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56) 1. Вишниченко В,К. и ПетеПлотностной анализ стандартныхдефектных вирионов, "Вопросырусологии", 1974, Р 6, с, 688 54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕФ НТЕРФЕРИРУЮЩИХ ЧАСТИЦ ВИРУСА утем заражения вирусом грипп й 7/00//С 12 Н 7/00; риных эмбрионов с последующим отбором вирусосодержащей аллантоиснойжидкости и выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью выделения целевого продукта, свободного от примесейинфекционного вируса и аллантоисныхбелков, вирусосодержащую жидкость .подвергают замораживанию-оттаива-нию и центрифугированию, затем по-.лученную надосадочную жидкость адсорбируют на куриные эритроциты иэлюируют целевой продукт охлажденным физиологическим растворомпри Соотношении объемов физиологического раствора и эритроцитов1:1,5 - 0,5.Способ осуществляют следующим об разом.Получение вируса.Накопление вируса гриппа проводят на куриных эмбрионах. Вирус с титром гемагглютинина от 1:б 4 до 1:512 раститровывают до предельных разведений, после чего заражают куриные эмбрионы. Инкубация куриных эмбрионов проходит при температуре +35,5 С в течение 72 ч, накопленный вирус выдерживают при температуре -20 Со в течение 3-10 сут, После размораживания в пул берут материалы с положительной реакцией гемагглютинации. Пул центрифугируют при 2,5 тыс. об/мин для удаления белков и других примесей,Сбор фракций вируса.фракционирование проводят на свежих или формалинизированных эритроцитах кур, предварительно отмытых 60 стерильным физиологическим раствором, Вирус адсорбируют на эритроцитах в течение 1-1,5 ч при температуре (+4 в + 6. Соотношение вирусосодержащей жидкости и эритроцитов 65 Изобретение относится к областивирусологии и может быть использовано для разработки вакцин на основе дефектных интерферирующих частиц,а также для различных вирусологических исследований с их применением.Известен способ получения .дефектных интерферирующих частиц вирусагриппа путем заражения вирусом гриппа куриных эмбрионов с последующимотбором вирусосодержащей аллантоисной жидкости и выделением целевогопродукта 1 .Однако известный способ не позволяет полностью освободиться отпримеси инфекционного вируса, получаемый целевой продукт содержитбольшое количество аллантоисных белков.Целью изобретения является выделение целевого продукта свободногоот примесей инфекционного вирусаи аллантоисных белков.Эта цель достигается тем, чтоспособ получения дефектных интерферирующих частиц вируса гриппа осуществляют путем заражения вирусомгриппа, куриных эмбрионов с последующим отбором вирусосодержащей аллантоисной жидкости и выделением.целевого продукта, при этом вирусосодержащую жидкость повергают замораживанию - оттаиванию и центрифугированию, затем полученную надосадочную жидкость адсорбируют на куриные эритроциты и элюируют целевойпродукт охлажденным физиологическимраствором при соотношении объемовфизиологического раствора и эритроцитов 1:1,5-0,5,1015203035 раьЪо 10:1, После адсорбции смесьцентрифугируют при 1,5 тыс,об/минв течение 5 мин. Снимают надосадочную жидкость. Для промывания к эритроцитам добавляют охлажденный физиологический раствор (+4 оС) в соотношении 2:1, эритроциты размешиваютпастеровской пипеткой и центрифуги- .руют при 1,5 тыс.об/мин в течение5 мин.После снятия промывной жидкостик эритроцитам добавляют охлажденныйфизиологический раствор в соотношении 1;1, эритроциты размешивают пастеровской пипеткой и оставляют дляэлюции при комнатной температуре. Через 1 ч проводят центрифугирование(1,5 тыс.об/мин 5 мин) и отсасывание пастеровской пипеткой элюата.К эритроцитам доливают новую порциюохлажденного, физиологического раство.ра, Элюаты снимают с интервалом в30 или б 0 мин до значительного снижения их титров гемагглютинина(0-134), Для предотвращения приростав используемый физиологический раствор и в пробирки для элюатов добавляют смесь антибиотиков.Проверка элюатов.У полученных элюатов кроме гемагглютинирующей активности проверяют инфекционность на куриных эмбрионах или на хорионаллантоисных оболочках куриного эмбриона (ХАО) . Инкубацию куриных эмбрионоь и ХАО проводят при температуре 35,5 С в тео,чение 48 ч,П р и м е р 1, Для выделениядефектных интерферирующих частиц(ДИЧ) берут вирус А/Гонконг/1/б 8,НЗ 2-2 с титром гемагглютинина1:128. После его накопления на куриных эмбрионах и замораживания100 мл вирусосодержащей аллантоисной жидкости адсорбируют в течение1 ч на свежих эритроцитах кур.Элюцию проводят в 10 мл физиологического раствора при температуре+21 С. Получают 21 элюат, дающиеположительную реакцию гемагглютинации. Инфекционность элюатов проверяют на куриных эмбрионах. На фиг. 1изображена динамика уровней гемагглютина и инфекционности элюатовА/Гонконг/1/68. Как видно из фиг.1элюаты с 11 по 18 при наличии высоких титров гемагглютинина оказалисьне инфекционными. При электронномикроскопическом исследовании элюатов выявлено различие в строениивирусных частиц из неинфекционныхэлюатов и высокоинфекционных. Длявирусных частиц из неинфекционныхэлюатов характерно отсутствие части генома. В табл. 1 представленырезультаты проверки интерферирующихсвойств элюатов, Как видно из табл.1элюаты, содержащие ДИЧ, снижакт ин803479 Таблица 1 Способ выделения дефектных интерферирующих частиц вируса гриппа Средние титры гемагглютинина (по разведениям)15 11 элю элюатов,атов +стандар- тный элюатов1 10 0 278 10 224 10 256 10 128 104 288 10 32 12 290 10 128 10 20 16 24 149 32 160 0 .- 80 160 Цельное фекционность и урожайность вируса стандартного. Все это подтверждает, что полученные элюаты являются фракциями дефектных интерферирующих частиц. Проверка первентивного действия полученных ДИЧ представлена в табл.2П р и м е р 2. ДИЧ выделяют из популяции вируса гриппа А/Порт Чалмерс/1/73, НЗ-3 с титром гемагглютинина 1:256, После его накопления и замораживания 150 мл 1 О вирусосодержащей аллантоисной жидкости адсорбируют в течение 1,5 ч при +5 оС на свежих эритроцитах кур. Элюцию проводят в 15 мл физиологического раствора при температуре 15 +20 С. Получают 65 элюатов, давших положительную реакцию гемагглютинации интервал между элюатами 30 мин), Инфекционность проверяют на куриных эмбрионатах. На фиг. 2 изображена динамика уровней гемагглютинина и инфекционности элюатов А/Порт Чалмерс/1/73, Как видно из фиг, 2, элюаты 27.и с 29 по 63 при наличии достаточно высоких титров гемагглютинина были не инфекционными. В табл, 3 представлены результаты про.проверки интерфирирующих свойств неинфекционных элюатов А/Порт Чалмерс/1/73.Как видно из табл, 3 неинфекционные элюаты снижают урожайность стандартного вируса, Данныеэлектронно-микроскопического изучения.также подтверждают принадлежность полученных элюатов к ДИЧ. Проверка превентивного действия элюатов представлена в табл, 2. Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет выделить дефектные интерферирующие частицы с более низким уровнем инфекционности (практически не инфекционные) . Способ позволяет выделить ДИЧ из популяции стандартного вируса, т.е. пассированного с невысокой множественностью инфекции. Получаемые ДИЧ обладают более выдержанным протективкым действием. В случае необходимости способ можно использовать для промышленной наработки вакцины на основе дефектных интерферирующих частиц.803479 Таблица 2динамика гибели юпаей, инфицированных стандартных вирусомгриппа и в комбинации с гомологичными ДИЧ День учета гибели ьншей 3 аражающийматериал 5 6 7 8 9 10 11 12 13 4 4 45 45 46 Стандартный А/НК/68 110 50 б ДИЧ А/НК/68 Стандартный + ДИЧА/НК/68 2 4 б б 7 7 Стандартный А/ПЧ/73 110 13 27 38 43 45 458 7 0. 5 45 4 б б 5 б А/ПЧ/7. Ст ан дар т ный +А/ПЧ/73 0 2 3 5 5 5 Табл Способ выделения дефектных интерферирующи частиц вируса гриппаСредние титр гемагглютинина по разведениям Разведение 31 злю 41 злюат5 31 ат элюатов тандарный 341 83 10 384 34 405 25 706 10 42 12 82 О о-г 313 299 341 768 Цельное СтандартныйПортЧалмерс ИнфекционныйЭИД/50 106 298 Общее число 14 ьишейЕйзаЧ-. цф и Э ф;Ф,аканлшоягзоюцз Составит иетова Техред МРедакт з 1069 ПодписноеСР илиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная/6 Тираж 523 НИИПИ Государственногопо делам изобретений 13035, Москва, Ж"35, Р ь С. Иалютинаепер Корректор А. Дзят комитета С и открытий ушская наб