Способ идентификации генотипов сорго

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 3 А 19) 01 й 33/6 1 Н 1/ 5)5 Т Я АВТ Т ельскиймса с 0111 чаг с 1. аоод ЕНОТИ 2 табл. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ И. Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к селекции и семеноводству, и может быть использовано научными учреждениями при создании и паспортизации линий, сортов и гибридов сорго.Целью изобретения является увеличение точности анализа.Способ состоит в том, что экстракциякафирина проводится после удаления иэ муки зерна сорго таниное (полифенолов) дистиллированной водой; иэопропанолом или этим растворителем, содержащим мочевину при нагревании, электрофорез или изоэлектрофокусирование белков осуществляется в пластинчатом полиакриламидном геле с последующим проявлением кафириновых компонентов трихлоруксусной кислотой и окраской кумасси В, определением относительной мобильности каждого из компонентов, составлением белковых (кафириновых) формул линий: сортов, гибридов сорго.Примдо тонкогозаливают 4 е р 1, Зерна сорго размалывают порошка, отвешивают 600 мг, 5 мл холодной дистиллированО(57) Изобретение. относится к биотехнологии и может применяться в селекционно-генетических исследованиях, Целью изобретения является повышение точности анализа, Способ состоит в том, что кафирин экстрагируют изопропанолом после удаления дистиллированной водой танинов, проводят разделение. в электрическом поле, после чего составляют белковые формулы, сопоставляя белковые спектры относительно реперного компонента В 5 о. 1 з,п, ф-лы,ной водой и выдерживают при 4 С в течение 30 мин. Центрифугируют при 8000 д в течение 15 мин, воду сливают, а осадок заливают 2 мл 70;-ного изопропанола, перемешивают и помещают в водяную баню на 1 ч при 60 С. После центрифугированиия при 8000 д в течение 15 мин супернатант упаривают досуха под феном и растворяют в 100 мкл 8 М мочевины, содержащей 20 сахарозы, 5 2-меркаптоэтанола и 0,60 уксусной кислоты. Раствор белка нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин и наносят в "карман" геля 40 - 50 мкл.Электрофореэ проводят в пластинчатом геле размером 110 х 110 х 1 мм, содержащем, 0: акриламид 10; метиленбисакриламид 0,2; уксусная кислота 2; ТЕМЕД 0,3; глицин 0,1; мочевина 8 М; аскорбиновая кислота 0,05; сернокислое закисное железо 0,001; персульфат аммония 0,025. Электродный буфер содержит 0,4 уксусной кислоты и 0,04 глиоина. Электрофорез ведут 30 мин при напряжении 250 В, а затем 3,5 ч при напряжении 500 В. После окончания электрофореза гели фиксируют в течение 30 мин в 100-ном растворе трихлоруксусной кис 1604273лоты, а затем окрашивают 0,001 )ь-ным раствором кумасси йв течение 1,5 - 2,0 ч при постоянном перемешивании,За репер принимают наиболее интенсивный компонент в средней части геля (Вю) и путем измерения расстояния от старта до положения каждого белкового компонента вычисляют подвижность (ОЭП). Компоненты группируют по подвижности; А - субфракция от 0 до 41, В - субфракция от 42 до 54, С - субфракция от 55 до 65 и О - субфракция от 66 до 100, и составляют белковые (кафириновые) формулы для каждого генотипа (по данным электрофореза), приведенные в табл.1.П р и м е р 2. Зерна сорго размалывают до тонкого порошка, отвешивают 200 мг му-, ки, заливают 15 мл холодной дистиллированной воды и оставляют при 4 С на 30 мин, центрифугируют при 8000 д в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а к осадку добавляют 2 мл 70;-ного изопропанола, содержащего 4 М мочевины, перемешивают и оставляют стоять на 30 мин при комнатной температуре, затем 1 ч - при 60 С на водяной бане, Проводят центрифугирование взвеси при 8000 д 15 мин. Надосадочную жидкость сливают, упаривают под феном до 1/8 - 1/10 первоначального объема и наносят на гель для изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в объеме 30 - 35 мкл на дорожку, На одну из дорожек наносят смесь белков - маркеров с известными ИЭТ. ИЭФ проводят в пластинках геля размером 240 х 110 х 0,5 мм, содержащего, : акриламид.5; метиленбисакриламид 0,27; ТЕМЕД 0,045; персульфат аммония 0,36; амфолит - носитель с интервалом рН 4 - 92; мочевина 7 М при 12 С. Режим ИЭФ: 15 мин 200 В, 15 мин 400 В, 15 мин 800 В, 45 мин 2400 В, После окончания ИЭФ гели фиксируют в 10-ном растворе ТХУ, содержащем 3,5 сульфосалициловой кислоты, в течение 30 мин, промывают 30 мин 10%- ным раствором ТХУ и окрашивают при постоянном перемешивании 0,001-ным кумаси й. ИЭТ разделившихся компонентов находят по калибровочной кривой, построеннойс учетом положений белков-маркеров с известными ИЭТ. Компоненты кафирина груп 5 пируют в соответствии с их ИЭТ:а-субфракция от 3,5 до 6,5; ф-субфракция от6,6 до 8,0; у-субфракция от 8,1 до 9,5, исоставляют специфические белковые (кафириновые) формулы для каждого, генотипа10 (по данным ИЭФ), приведенные в табл,2.Белковая (кафириновая) формула характеризует каждую линию, сорт или гибридсорго. На ее основе паспортные данные(цифровые) образца можно хранить в памя 15 ти ЭВМ,Предлагаемый способ идентификации генотипов сорго отличается объективностью,надежностью, быстротой при распознаваниисортов, линий, гибридов сорго, Белковые фор 20 мулы можно хранить в памяти ЭВМ,Формула изобретения1. Способ идейтификации генотипов 25 сорго, включающий экстракцию проламинов из размолотых зерен, их разделение в электрическом поле и анализ полученных белковых спектров, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения точности ана лиза, кафирин экстрагируют после удалениядистиллированной водой танинов изопропанолом при нагревании с дальнейшим восстановлением дисульфидных связей, белковые спектры анализируют путем опре деления электрофоретической подвижности каждого компонента и группировки их в соответствии с их мобильностью относительно реперного компонента Вщ с дальнейшим составлением белковых формул.40 2, Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что при изоэлектрофокусировании экстракцию кафирина производят изопропанолом, содержащим мочевину, без восстановления дисульфидных связей, при 45 этом белковый спектр анализируют путемопределения изоэлектрических точек компонентов по маркерным белкам.