Способ определения концентрации иммуноглобулинов в биологической жидкости

(51)5 6 3 5 ГОСУДАРСТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБаЕТЕНИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ(71) Карагандинский государственный медицинский институт(56) Авторское свидетельство СССРМ 1050668, кл. 6 01 й 33/48, 1983,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИММУНО ЛОБУЛИНОВ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ(57) Предлагаемое изобретение относится кмедицине, а именно к иммунохимии. С Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано в клинической иммунологии для определения концентрации имунноглобулинов в биологической жидкости.Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа.Способ осуществляют следующим образом,Готовят гель, содержащий 0,8 - 1,8% агара, 2 - 3% полиэтиленгликоля и 7 - 10% этиленгликоля. Для этого в физиологический раствор засыпают соответствующее количество агара и оставляют на 2 - ,3 ч для набухания. После этого добавляют полиэтигликоль и этиленгликоль в соответствующих количествах и инкубируют при 80 С в течение 2 ч. Получают агаровый гель, который можно хранить до использования в холодильнике. Полученный агаровый гель доводят до 50 С, после чего к нему прилицелью упрощения и повышения точности способа применяют приготовляемый в виде полосок толщиной 2 - 3 мм агаровый гель (0,8 - 1,8 %), содержащий полиэтиленгликоль (23 %) и этиленгликоль (7 - 10 %), на.который накладывают полоски (2 х 5 мм) хроматографической бумаги, например М 15, пропитанные исследуемой жидкостью, с последующим измерением участков преципитации, просветпяемых после инкубации 10 - 15 % - ным раствором уксусной кислоты, Применение способа в практике позволяет повысить точность определения в 6 раз, снизить травматичность, увеличить сроки хранения системы до 1 года и снизить расход материалов в 3 - 5 раз. вают моноспецифическую антисыворотку к иммуноглобулинам класса А, М или 6 в таком количестве, чтобы конечная концентрация в растворе соответствовала указанной на ампуле, перемешивают и используют для заготовки пластин с полосками агарового геля. Для этого на пластину из стекла или прозрачной пластмассы накладывают трафарет, позволяющий получать полоски геля шириной 2 - 3 мм на расстоянии 5 - 6 мм друг от друга, лежащие на ппоскбсти пластины.После застывания агара трафарет снимают (можно испольэовать разовые трафареты и не снимать их, оставляя в системе), Разные области пластины можно заполнять агаровым гелем с антисыворотками к иммуноглобулинам разных классов, окрашивая агар с разными антисыворотками красителями разного цвета - тогда на одной пластине будут полоски агара с антисывороткамипри 80 С йериодически перемешивая, в течение 2 ч. Полученный гель использовали 40 для получения геля с антисывороткой к иммуноглобулинам класса А, М или 6, Для этого температуру геля доводили до 50 С и добавляли соответствующую антисыворотку в количестве, определенном инструкцией используемого комплекта, тщательно перемешивали 3 - 4 мл полученной смеси заливали на предварительно нагретую до50 С прозрачную пластину размером 8 х 12 см с приклееным к ней трафаретом из пластмассы толщиной 2 мм. Пластина должна лежать в строго горизонтальном положении. В результате на пластине получали 11 полос агара шириной 2 мм, длиной 11 см. После застывания геля и охлаждения пластину накрывали крышкой, герметизировали при помощи пластиковой изоляционной лено ты и хранили до использования при 1 - 8 С.Перед использованием систему(пластинус полосами геля) доводили до комнатной для определения содержания иммуноглобулинов разных .классов, окрашенные в : разные цвета. Полученную готовую систему . для определения содержания иммуноглобулинов накрывают крышкой, герметиэируют при г 1 омощи клейкой полиэтиленовой ленты и хранят при, - 8 С до 1 года.Перед использованием систему вскрывают, на полосы агара перпендикулярно к ним накладывают стандартные полоски хроматографической бумаги, например М 15, размером 2 х 5 мм, пропитанные тестируемой жидкостью, так, чтобы концы этих полосок находились вне полоски агара, Накладывают также полоски, пропитанные контрольной сывороткой в различных разведениях. Затем систему с нанесенным тестируемым материалом вновь закрывают крышкой, герметизируют клейкой полиэтиленовой лентой и инкубируют при 36 С в течение 12-40 ч. После окончания инкубации крышку снимают, пластину погружают в 10 - 15 -ный водный раствор уксусной кислоты, через 10 мин вынимают и измеряют ширину преципитата при помощи. бинокулярной лупы. По, данным контрольных сывороток в разных разведениях строят кафь либровочную кривую, по которой определяют содержание иммуноглобулинов в сывортке или другой текстируемой жидкости.П р и м е р 1. 08 г агара заливали 50 мл физиологического раствора, оставляли для набухания на 2 - 3 ч. После этого добавляли 2 г полизтиленгликоля и 7 г этиленгликоля и доливали физиологический раствор до общей массы раствора 100 г,тщательно перемешивали и инкубировали 5 10 15 20 25 30 35 температуры, затем раскрывалй. Полоскихроматографической бумаги размером 2 х 5мм брали эа конец пинцетом, пропитывалитекстируемым материалом и накладывалиперпендикулярно полосам геля на расстоянии 1 - 1,5 см друг от друга, плотно прижи- .мая к поверхности геля пинцетом, Наполосы геля накладывали также полоски бумаги, пропитанные стандартной сывороткой человека, неразведенной и вразведениях 1;2, 1.4, 1:8, 1:16. После нанесения всех образцов указанным способомсистему вновь герметично закрывали, герметизируя клейкой пластиковой лентой, иинкубировали при 37 С для )цб до 22 ч, для,) оА до 24 ч, для ) цМ до 40 ч. Затем пластиныпогружали в 100 - ный водный раствор уксусной кислоты. Через 10 мин пластинывынимали и измеряли ширину "проявленных" преципитатов при помощи бинокулярной лупы с,окуляр-микрометром. Постандартной сыворотке в разных разведениях строили калибровочную линию, по которой определяли содержание иммуноглобулинов в тестируемой жидкости.Указанным способом тестировали следующие образцы,1, У горнорабочего В., 29 лет, выделялисыворотку крови, Сыворотку хранили в замороженном состоянии, перед тестированием размораживали.2, У горнорабочего М., 45 лет, выделялиплазму крови (центрифугированием гепаринизированной крови). Плазму хранили в замороженном состоянии, перед тестированием размораживали,3. У лаборанта А 24 г прокалывалипалец, полоски хроматографической бумагинепосредственно перед определением пропитывали кровью из пальца.4, У больного С 37 лет (диагноз - варикозное расширение вен правой нижней конечности в стадии декомпенсации,трофическая язва голени) полоски хроматографической бумаги пропитывали отделяемым язвы.5. У больного М., 42 лет (диагноз - стоматит автозный), полоски хроматографической бумаги прикладывали к пораженнымучасткам слизистой оболочки полости рта.6, У горнорабочего СЗО лет, брали слюну. Хранили в замороженном состоянии, перед тестированием размораживали.Данные анализов приведены в табл, 1.П р и м е р 2, Агаровый гель с антисыворотками и систему для определения иммуноглобулинов готовили так же, как впримере 1, но на 100 г раствора брали 1 гагара, 2,5 г полиэтиленгликоля, 10 г этиленгликоля, Для "проявления" использовали1603301 Таблица 1 ЭПримеры использования способа при тестировании различных биологических жидкостей Р 15-ный водный раствор уксусной кислоты. Тестировали те же жидкости, что и в примере 1. Результаты анализов приведены в табл. 1.П р и м е р 3. Агаровый гель с антисыворотками готовили так же, как в примере 1, но брали 1,8 О агара, 3 полиэтиленгликоля,8;ь этиленгликоля. К прозрачной пластине размером 8 х 12 см плотно прижимали и закрепляли трафарет, равномерно смазанный вазелином. Пластину нагревали до 50 С, после чего заливали гелем (3 - 4 мл на пластину) при 50 С, Посде застывания геля трафарет аккуратно снимали. Получали 10 повосок агара шириной 3 мм, длиной 11 см. Готовую систему накрывали, герметизировали при помощи изоляционной ленты и хранили при- -8 С до использования, Для "проявления" преципитатов использовали 12 - ный раствор уксусной кислоты. Тестировали те же жидкости, что и в примере 1. Результаты анализов приведены в табл. 1,Данные, подтверждающие достижение указанной цели, представлены в табл, 2 и 3.Из табл. 2 видно, что ошибка, получаемая при тестировании одной пробы трижды по предлагаемому способу, достоверно (рО,001) и существенно (в 6 и более раэ) ниже, чем по прототипу, что свидетельствует о повышении точности предлагаемого способа по сравнению с прототипом,Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: область применения предлагаемого способа существенно шире эа счет снижения материалоемкости и увеличения длительности хранения системы от 2 недель до 1 года; он требует материалов в 3 - 5 раз меньше, обладает более высокой точностью в связи с работой по принципу линейной иммунодиффузии, менее трудоемок, так как не требует пробивания лунок, внесения в них тестируелпй жидкости при помощи мик рошприца, окрашивания; удобен, посколькупредполагает внесение материала для исследований непосредственно из объекта без предварительного забора й подготовки ма- териала; требует очень мало тестируемого 10 материала, что позволяет определять иммуноглобулины в отделяемом ран, в локальных областях поверхности слизистых оболочек, в крови непосредственно из пальца (не только у взрослых, но, что особенно важно, 15 у детей младшего возраста) или из ран, значительно менее травматичен для пациента,Предлагаемый способ полностью готовк применению и может быть рекомендован к широкому использованию в клинических 20 иммунологических лабораториях и в экспедициях при проведении массовых иммунологических обследований.Формула изобретения Способ определения концентрации иммуноглобулинов в биологической жидкости путем пропитывания носителя исследуемой жидкостью с последующим нанесением на агаровый гель, содержащий антисыворотку, 5 инкубации и вычисления концентрации позначению участков преципитации, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, вводят 2 - 3% - ный полиэтиленгликоля и 7-10 этиленгликоля в агаровый гель, иэ которо го готовят полоски шириной 2 - 3 мм, послечего на них накладывают полоски носителя иэ крупнопористой хроматографической бумаги, а после инкубации участки преципитации обрабатываются 10 - 15 - ным 40 раствором уксусной кислоты.1603301 Продолжение табл. 1 Таблица Ошибка, получаемая при троекратном тестировании одной пробы и гаемому впособу и и рототипу ( исследовано 48 проб плазм предлаТэб 3 Кол во материалов, используемых для тестирования по трем классам иммуноглобулинов 960 образцов Составитель Н. Валеева Касарда Техред М.Моргентал КорректРедакт каз 3382 Тираж 514 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 ий комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 изводственно-издател