Способ исследования апо-в-липопротеинов в сыворотке крови

(плазмы) крови добавляют 0,04 мл гепарина (1000 МЕ/мл) и 0,05 мл раствора хлористого марганца (2 моль/л).После получасовой экспозиции пробыв ледяной бане и последующего еецентрифугирования в течение 30 мин 1 Опри 3000 д отбирают пипеткой 0,05 млнадосадочной жидкости (т.е. сыворот"ки, лишенной апо-В-содержащих липопротеинов) и производят диск-электрофоретическое исследование спектра 15белков, Фракционированных в столбиках полиакриламидного геля.Способ диск-электрофоретическогофракционирования белков (гликопротеинов) сыворотки крови и супернатанта, 20не содержащего апо-В-ЛП.Реактивы. Исходные реагенты; 1 н.НС 1, ТРИС, тетраметилэтилендиамин(ТЕМЕД), метиленбисакриламид (БИС илиМБА), персульфат аммония рибофлавинф 25сахароза, уксусная кислота ледяная",1 н, раствор КОН, 1 моль/л раствораортофосфорной кислоты.Схема получения исходных растворовдля полимеризации геля. 30Раствор 1 т рН 8,9, 1 н, НС 1 - 48 мл;ТРИС - 36,6 г, ТЕМЕД - 023 мл, вода - до 100 мл,Раствор : акриламид - 30,0 г,БИС - 0,8 г, вода - до 100 мл. 35Раствор 3: аммоний надсернокислый(персульфат аммония) - О,4 г, водадо 100 мл (раствор должен хранитьсяне более 7 сут в холодильнике).Раствор 4: рН 6,8; 1 н. НС 1 - 48 мл, 40ТРИС - 5,98 г, раствор ортофосфорнойкислоты - 25,6 мл, вода - до 100 мл.Раствор 5: акриламид - 10,0 г,БИС 2,5 г; вода - до 100 мл.Раствор 6: рибофпавин - 0,004 г, 45вода - до 100 мл.Раствор 7: сахароза - 40,0 г, вода " до 100 мл,Растворы могут сохраняться в течение нескольких недель (до 4 мес.в темных склянках в холодильнике при+4 С).Схема приготовления мелкопористогоразделяющего геля с концентрациейпо акриламиду 40 г/л; рН 8,9 (смесь1 ш): 1 объем раствора 1, 2 объема55раствора. 2, 1 объем бидистиллированной водыф, рН 89. К полученной смесидобавляют равный обьем раствора 3. В конечном итоге схема приобретает следующий вид: 1 объем раствора 1, 2 объема раствора 2, 1 объем бидистиллированной воды, рН 8,9, 4 объема раствора 3.Схема приготовления крупнопористого концентрирующего геля: 1 объем раствора 2 ф, 2 объема раствора 5;1 объем раствора 6; 4 объема раствора 7Схема приготовления основного раствора для электродного буфера: . ТРИС - 6,0 гф глицин - 28 8 г, вода дистиллированная - до 1000 млф рН 8,3,Перед употреблением разбавлять в 10 раз.Схема приготовления раствора красителя: бромфенол синий - 0,001 г, вода дистиллированная - до 100 мл.Схема приготовления красящего раствора - Фиксатора: амидо-черный 10 В - 1,0 г раствор уксусной кислоты концентрации 10 г/100 мл - до 100 мл.Консервирующим раствором - дифференциатором является раствор уксусной кислоты концентрации 7 г/100 мл.Оборудование. Для проведения аналитического диск-электрофореза в ПААГ используются отечественные приборы, предназначенные для этой цели: ПЭФА - 1, некторые другие и аппараты венгерской фирмы "Реанал" (модель Р 69).Ход выполнения методики. Хранимые в холодильнике реактивы перед исследованием вынимают и выдерживают некоторое время при комнатной температуре для их согревания. Стандартные стеклянные трубочки с отшлифованными концами укрепляют в специальной подставке согласно инструкции, прилагаемой к прибору. Далее приготовляют раствор мелкопористого геля с рН 8,9. Основные растворы (1 объем смеси 1 и 1 объем раствора 3) тщательно смешйвают в небольшой склянке. С целью предотвращения образования в процессе полимеризации геля воздушных пузырьков, в значительной мере препятствующих процессу разделения, желательно удалить иэ основных растворов воздух, для чего можно испольэовать подключенный к склянке водоструйный или другой отсос.В стеклянные трубочки пипеткой вносят по 2 мл раствора мелкопорис511 того геля, слепя за тем, чтобы в нег не попали пузырьки воздуха, На поверхность этого раствора наслаивают 0,2-0,3 мл дистиллированной воды или разведенного буфера . Для ускорения 1 олимеризации трубки освещают лампой дневного света. По истечении 30 40 мин процесс завершается, о чем можно судить по слабому нагреванию стеклянных трубочек, а также по образованию хорошо различимой границы между полиакриламидным гелем и водной фазой. Быстрым движением руки осторожно стряхивают с геля наслоенную жидкость (ее можно удалить из трубок и с помощью Фильтровальной бумаги).При приготовлении раствора крупно. пористого (верхнего) геля. отсасывать воздух из,. раствора необязательно, однако готовящуюся смесь желательно предохранять от воздействия яркогосвета (из-за чувствительности к нему рибофлавина). Стеклянные трубочки ополаскивают 0,1-0,2 мл раствора мономера (для полного удаления других компонентов) и в каждую колонку пипеткой вносят 0,2 мл раствора мономера, используемого для приготовления крупнопористого концентрирующего геля. Затем известным способом наслаивают 0,1-0,2 мл бидистиллированной воды.Полимеризацию геля осуществляют за счет фоточувствительного катализатора рибофлавина. Поэтому штативы с гелями располагают около ультрафиолетовой лампы мощностью 250-500 Вт иди другого источника яркого света.но завершении полимеризации верхнего слоя (на что требуется около получаса) нанесенную жидкость сливают с крупнопористого геля, а геле вые трубочки ополаскивают раствором крупнопористого мономера, ранее при готовленного для анализа.Сформированный (объем 0,2 мл) диск, соприкасающийся с мелкопористым гелем, производит концентрирующий эффект.В колонку (трубку) вносят 0,01 м анализируемой сыворотки и. наслаивают электродный буфер, разбавленный в 10 раз. В случае, если пробу вносят вместе с крупнопористым мономером, полимеризацию его желательно проводить при ультрафиолетовом осве щении. При применении же в качестве разбавителя биологической жидкости 6032806о раствора мономера с сахарозой (раст-,вор 7) полимеризации не требуется,Верхнюю часть прибора стыкуют с5нижним буферным резервуаром, которыйпредварительно заполняют разбавленным в 10 раз буферным раствором.Ухудшающие электрический контакт воздушные пузырьки удаляют с концов тру"10 бочек, входящих в буферный растворнижнего резервуара, многократным,но осторожным встряхиванием раствораили иным способом (например, шприцемс иглой, заполненным электродным бу"15 фером). Осторожно приливают в верхнийрезервуар десятикратно разбавленныйбуферный раствор. Камеру желательнопоместить на время проведения электро.фореэа в холодильник.20 В течение первых 15 мин электрофорез проводят при силе тока, непревышающей 2 мА на каждую отдельнуютрубочку (для этого нужно установитьнеобходимое напряжение). Затем силу25 тока следует увеличить до 5 мА накаждую трубочку, Ток пропускают дотех пор, пока окрашенное кольцо буфера не достигает уровня, отстоящегона 5 мм от нижнего края столбика полиакриламидного геля (на что уходит1 - 1,5 ч), После завершения электрофореза гелевые трубочки вынимаютиз верхнего резервуара, Гель из стек.лянных трубочек можно легко удалить,перемещая стальную иглу в промежутке5 между гелем и трубочкой под слоемдистиллированной воды. Извлеченныйгель погружают на 20-30 мин в раствор-фиксатор, внесенный в пробирки.40После окрашивания гели обеспечиваютэлектрофоретически с помощью специального для этого приспособления,Для выявления гликопротеинов столбики полиакриламидного геля Фиксиру"45 ют в течение ночи в водном раствореизопропанола (250 г/л), затем 2 ч отмывают дистиллированной водой и погружают на 50 мин в раствор йодной кислоты концентрацией 10 г/л, приго 50 товленной в 0,2 моль/л раствора л ацетата натрия. После повторного от"мывания дистиллированной водой (в течение 1 ч) столбики полиакриламидного геля помещают на 50 мин в реактив Ыиффа, Затем столбики геля обрабатывают в течение 30 мин (лучше 3 раза по 10 мин) свежеприготовленным 5 г/л раствором метабисульфита натрия и отмывают дистиллированной3280 51015 20 25 30 35 40 45 1601 водой, Гели хранят в растворе уксусной кислоты концентрации 70 г/л.Гелеграммы белков и гликопротеинов одной и той же пробы сыворотки(путем нахождения площадей пиков, составляющих отдельные Фракции белков и гликопротеинов, их суммации и оп. Ределения относительного количест.- венного содержания) предварительно осуществив качественную идентификацию белков и гликопротеинов.Полученные денситограммы дискэлектрофореграмм трех проб одной итой же сыворотки (плазмы) крови,двеиз которых составляют спектр белковнативной сыворотки (плазмы) и сыворотки (плазмы), лишенной апо-В-ЛП,а третья - спектр гликопротеинов нативной сыворотки (плазмы), сопоставляют, обращая внимание на исчезнувшие (по сравнению со спектром сыворотки, лишенной апо-В-ЛП) белки нативной (цельной) сыворотки или плазмы крови (они являются апо-В-липопро.теинами) и на изменение соотношения ,между белковым и углеводным компонентами в выявленных зонах белков.При сравнении между собой дискэлектрофореграммы белков супернатанта плазмы и диск-электрофореграммыбелков плазмы видно отсутствие вспектре белков супернатанта,плазмыряда белковых Фракций, обнаруживаемых в плазме крови между линиейстарта и трансферрином.Более полное представление об этомдают денситограммы соответствующих . диск-электрофореграмм белков супернатанта плазмы, лишенной апо-В-ЛП исамой плазмы.Следовательно, используя предлагаемый способ получения апо-В-ЛП,становится возможным не только выявить их место в диск-электрофоретическом спектре белков, но и судить об изменении (если таковое имеет место) соотношения между углеводными и белковыми компонентами в апо-ВЛП при разных формах патологии.Использование изобретения позволяет повысить точность исследования за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липопротеинов, а также за счет двухкратного снижения ошибки измерения, упростить способ за счет сокращения трудоемких операций (в 1,9 раза) и времени исследования (в 4 раза); сохранить нативность исследуемых апобелков. формулаСпособ исследования апо-В-липопротеинов в сыворотке крови, включающий осаждение апо-В-липопротеинов и идентификацию апобелков дискэлектфорезом в полиакриламидном геле,отличающийся тем, что., с целью повышения точности способа за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липопротеинов, и сохранениянативности апобелков при одновременном упрощении способа за счет сокращения числа трудоемких операций, одновременно проводятэлектрофорездвух проб нативной сыворотки и пробысыворотки, из которой предварительноудаляют апо-В-липопротеины, затем окрашивают на белок электрофореграммыпробы, лишенной апо-В-липопротеинов,и одной пробы нативной сыворотки и науглеводы вторую пробу нативной сыворотки, сравнением электрофореграмм,окрашенных на белок, выявляют апо-Влипопротеины, а сравнением электрофореграмм нативной сыворотки, прокрашенных на белок и углеводы, определяют нагруженность Фракций апо-В-липопротеинов углеводами.