Способ внутритиповой дифференциации полиовирусов

/00 ЕТЕНИЯ естосГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИ ТОРСЙОМУ СВИДГГЕЛ(56) Ворошилова М.К. Знтеровирусныеинфекции человека, - М., 1979, с, 148189.Казанцева В,А, Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающейсреды. - М., 1982, с,43-59,Изобретение относится к областивирусологии и может быть использовано для дифференциации вирусов полиомиелита.Цель изобретения -. повышение точности дифференциации,Для этого исследуемые изоляты вирусов полиомиелита параллельно культивируют в фибробластах эмбрионачеловека и перевиваемой линии клетокНери при наличии разницы в титре( 2,0; 2-3 и ) 3,0 1 в ЦПД о относят к диким, промежуточным или вакцинным соответственно,П р и м е р 1. Приготовление ткультуры, Ткани туловища и конечнтей плода 2-4 мес беременности измельчают ножницами до мелких кусочковразмером 2-4 мм, затем промывают три(54) СПОСОБ ВНУТРИТИПОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПОЛИОВИРУСОВ(57) Изобретение относится к вирусологии и может применяться для дифференциации вирусов полиомиелита, Цельизобретения - повышение точности диференциации, Изоляты вирусов полиомиелита параллельно культивируют вфибробластах эмбриона человека и перевиваемой .культуре Нери при наличии разницы в титре 2,0 1 КЦПДуомл2,0-3,0 ЦПД,и3,01 рцПД.ьоумл,относится к диким, промежуточным и вакцинным соответственно.2 табл,раза в растворе Хенкса, рН 7,4. Измельченную ткань трипсинизируют,Полученную суспензию клеток осаждают центрифугированием при 1500 2000 об /мин в течение 15 мин и помещают в холодильник до смешивания с клетками последующих экстракций. Смешанную суспензию клеток, полученную после всех экстракций, центрифугируют при 1500.-2000 об /мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость отбрасывают, клетки ресуспендируют в среде с 0,53-ным раствором гидро" лизата лактальбумина на растворе Хенкса, рН 7,0. Осадок ресуспендируют в питательной среде для выращивания клеток до концентрации 250 тыс, клеток в 1,0 мл. В качестве среды для выращивания клеток использовали50 3 15834 среду с 0,5 гидролиэата лактальбумина на растворе Хенкса рН 7,0 среду .199 на растворе Хенкса, рН 7,2, в каждую из которых добавляли сыворотку крупного рогатого скота (10,03) и антибиотики из расчета 25 тыс.единиц пенициллина и 25,0 мг стрептомицина на 100,0 мл среды.Перед пересевом культуры Нер10 проводят просмотр и оценку монослоя. Отбирают культуру со сплошным моно- слоем клеток, имеющих типичную для данной линии морфологию, с четко вы раженными границами между клеткамиКлетки снимают со стекла матрасов трип син-версеном. Для этого готовят смесь равных объемов 0,25 ь-ного раствора , трипсина и раствора версена, подогревают ее в водяной бане до 30-35 С.Вначале с матраса выливают питательную среду, клеточный слой промывают три раза Фосфатно-буферным раствором(рН 7,5), не содержащим ионы кальцияи магния. Затем теплой смесью (трипсин-версен) заливают монослой культу-. ры клеток, В матрасы объемом 100,250 и 1000 мл раствор добавляют соответственно по 10, 15 и 30 мл. Матрасы встряхивают и помещают в термостат .(37 С) на 15-20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла.Взвесь клеток разводят питательной средой с таким расчетом, цтобы в 0,1 мл содержалось 60 тыс. клеток,В качестве среды для выращивания33клеток используют среду Игла, МБМ, рН 7,2, с добавлением телячьей сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота (10,0-ной) и антибиотиков,Первично трипсинизированные клеткиФЗЧ и перевиваемые Нерразливаютв пробирки по 1,0 мл,Для поддерживания клеток используют приведенныепитательные среды без добавления сыворотки, В пробирках среду меняютчерез 4 сут культивирования клеток.Обновление сплошного монослоя клетокновой генерации наблюдают через 56 сут.П р и м е р 2. Проводят сравнительную внутритиповую дифференциацию96 вирусов полиомиелита, выделенныхот больных полиомиелитом, из сточныхвод, а также стандартных штаммов:диких - МаЬопеу, МГР, БааЕе, ивакцинных - Ьа с 2 ав, Р 712 СЬ 2 ав и1. еоп 12 зв, по ряду известных маркеров (гес 40 , 1 л, А А, И, Ар), а также по предлагаемому признаку ФЭЧ.Титрование иэолятов вируса осуществляют параллельно в культуре клетокФЭЧ и Нерметодом конечного разведения по цитопатическому действиюи выражают в 1 а ЦПД,Для титрованияполиовирусов готовят десятикратныеразведения от 10до 10Перед заражением монослоя культуры ФЗЧ и Нерполиовирусами производят 3-кратное омывание культуры клеток от сыворотки раствором Хэнкса,рН 7,4, или раствором Эрла, рН 7,6,На каждое десятикратное разведениевируссодержащего материала исполь"эуют по четыре пробирки с культуройклеток. Вируссодержащий материалвносят на монослой клеток в объеме0,1 мл, затем клетки инкубируют при37,0+0,1 С в течение 60 мин, послечего вносят поддерживающую среду .без сыворотки. Инкубирование зараженных полиовирусами культур ФЭЧ и Нер производят при 37,0+0,1 О С в течение7 дн. Результат цитопатического действия ЦПД полиовирусов считают положительным, если не менее половиныклеток в культуре подвергались специФической дегенерации.Результаты исследований уровняРепродукции изолятов вирусов полиомиелита того или иного иммунологи-,ческого типа в параллельно зараженных культурах ФЭЧ и Неручитываютпри соблюдении следующих контролей:монослой незараженных культур Нер и ФЭЧ должен сохраниться до концаопыта, т,е. до седьмых суток включительно после заражения (контролькультуры клеток); разница в уровнерепродукции в культуре клеток Нер и ФЗЧ для аттенуированных стандартных полиовирусов (Ев с 2 ав, Р 712 СЬ 2 ав,Ьеоп 12 ав) цолжна быть10 " ЦПД отогда как для диких (уличных стандартных вирусов полиомиелита (МаЬопеу, МБР, БацЕес этот показа"тель составляет 10 " ЦПД гомл(табл. 1),Статистическая обработка данныхрепродукции аттенуированных, промежуточных и диких (уличных) штаммоввирусов полиомиелита свидетельствуето том, что разница в уровне размножения в культуре клеток ФЭЧ и Нер для отдельных указанных групп,полиовирусов внутри одного и того же иммунологического типа достоверно отли510 30 35 Таблица 1 КультуШтамм РазниТитр вирусав ЦП 1 ра клеца титров в ток Нер ФЭЧнер-гФЭЧНер ФЭЧНер ФЭЧНер ФЭЧНер ФЭЧ 7,2+0,21 Б,4+о,го 7,9+0,21 7,1+о,го 6,4+0,224;8+0,23 6,8+0,23 3,4+0,22 7,6+0,23 4,4+0,20 61+0,20 3 10 20 1,8 МааолеуНЕР0,8 1,6 ЗайессЬв С 2 ав 3,4 Р 712 Слгав 3,2 Ьеоп 12 ав 3,о 5 158чается (Р = 0001). Из 44 исследованных полиовирусов всех трех иммунологических типов, для 14 штаммов вируса полиомиелита типа 1, имеющих генетическую характеристику ген 40 , 1 ц,А-, М ; а в антигеннрм отношении сходных со штаммами Коньков, Коньков ++ 1.вс 2 ав и МаЬопеу разница составляет ( 2,0 1 д ЦПД г . Исключениесоставляет один штамм, имеющий гене-,тическую характеристику гес 40 , 1 о ,А", И; а в антигенном отношениисходный с промежуточным вариантомКоньков + Ыс 2 ав. Для этого штаммаразница в тит 1 е составила 2,5 1 ЦПДа 7,лОстальные 39 штаммов этогоже типа имеют генетическую характеристику ген.40, 1 ы, А, И-, а вантигенном отношении сходны со штаммом 1.вс 2 ав. В данном случае разницатитров вирусов полиомиелита3,0 1 ДЦПДау,ил (табл, 2),Сходные резул,таты получают припараллельной количественной индикации 22 и 30 штаммов полиовирусов типа11 и 111 соответственно в этих жекультурах клеток. Величина разницытитров штаммов вирусов полиомиелитатипа 11, имеющих характеристики ген40 ф, Ьц , А , Ы , а в антигенном отношении сходных со штаммами МЕР,была2,0 1 в ЦПД ., , тогда как дляостальных 18.штаммов полиовирусов,у которых известные генетические маркеры ген 40, 1,и+, А, 0 не коррелируютмежду собой, а в антигенном отношении сходные со штаммом Р 7)2 С 1 т 2 ав, этаже величина составляет ) 30 1 д ЦПД а(ьл,Такая же динамика размножения характерна и для штаммов полиовируса типа111, Уровень размножения 18 штаммов 3441 6 вируса полиомиелита, имеющих генетическую характеристику гейф 40 ф, Ьц,А и сходных в антигенном отношениисо штаммом Байесг был на(2,0 1 д ЦПД а,и, выше в клетках Нер, чемв ФЭЧ. Для 12 штаммов втруса полиомиелитатипа 111, сходных по некоторым генети"ческим признакам с вакцинными штаммамиэта разница составляет )3,0 1 дЦПД о уи Применение способа внутритиповой дифференциации энтеровирусов пс; признаку ФЭЧ опережает по стабильности ряд генетических признаков, в том числе Мз, и во всех случаях совпадает с антигенным признаком (Ад), Это позволяет использовать признак ФЭЧ как новый генетический маркер, обеспечивающий более точную предварительную дифференциацию вирусов полиомиелита на вакцинные, промежуточные и дикие варианты.Формула и з о б р е т е н и я Способ внутритиповой дифференциации полиовирусов, включающий установленные разницы титров при параллельном выращивании вируса в двух культурах различного происхождения, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности дифференциации, в качестве культур используют фибробласты эмбриона человека и перевиваемую линию Нери при разнице в титре меньше 2 1 ЦПД2,0-3,0 1 ЦПД а 7, и больше 3,0 к 4.в ЦПДштаммы относят к диким, промежутоцйым или вакцинным соответственно.