Способ криоконсервации спермы птиц

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 2 О 7/О 4 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ й:ЕЯЩ 3 ЦЯ1 Юс 4 Юь 1,ЧО С БАОА л. 1 44аучно-исслцеводстваА.В,ТереЛинник доват нко 088(56) Авто И 1136806 ое свидетельство СС л. А 61 Р 7/02 198(57) Изоббиологиибыть испо КРИОКОНСЕРВАЦИИ СПЕ тение относится к областизмножения животных и можетзовано в криобиологии и к биологии жет бытьии генетике их ресурявляально повы лно ие известного в криоконсерслужила спе ггорн, родтые. Исполь индивидуых и функциоспермиев в отт ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(21) 4395197/30- (22) 22,0388 (46) 30.11.89Б (71) Украинский ский институт пт (72) Н,И.СахацкиА.Н,Новиков, Т.П и А.Б.Артеменко(53) 636.082,453 Изобретение относится размножения животных и м использовано в криобиолог для консервации генетиче сов домашних, птиц. Целью изобретения шение числа функцион ных спермиев. П р и м е р. Сравнен и предлагаемого способо вации спермы птиц. Объектом исследований ма петухов пород белый л айланд, полтавские глини зовалась как смесь, так альные эякуляты. Число поврежденн нально полноценныхгенетике для консервации генетических ресурсов домашних птицЦелью изобретения является повышение числа функционально полноценных спермиев. Способ заключается в ступенчатом охлаждении разбавленной и эквилибрированной спермы до начала кристаллизации со скоростью 10-20 град/мин, а затем выдерживании в течение 1-3 мин и ступенчатом замораживании до, температуры от -16 до -2 С со скоростью. 25- 30 град/мин, от -80 до -90 С со скоростью 50-70 град/мин и до -196 С со скоростью 30-50 град/мин. Использование способа позволяет увеличить выход функционально полноценных сперЮ миев в 5,5 раз по сравнению с известным способом. 5 табл,ной сперме определяли по известной методике.Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.Свежеполученную сперму разбавляют в соотношении 1:1 при комнатной температуре любой из известных защитных сред, например ЛКС, и помещают в холодильник при 2-4 С на 45 мин, В сперму добавляют криопротектор,например диметилацетамид или диметилформамид и эквилибрируют, В процессе эквилибрации проводят расфасовку спермы, например, в полиэтиленовые пробирки емкостью 0,6 мл, которые при необходимости маркируют, а в одну из них вставляют термопару, подсоединенную к контрольнО-измери:з -,1:о;: :а;ри. :.яи,агав ц,.:= к ооцесса отчетливо видно ,. . ;, иэмери ьельном приборе,на Гп ) приостанавливание температуры,., ид;,:, ке . течение.и.зации спермы домин выл,ц функциоально голоценных 40 .-;ерм ев .ос.таиля; 17,5+5 Ж, 1 мин 55,: .,2, 2 мин - 27,5+",5 Ж, 3 мин 7 ) ф пл5 О+5 От 5 рнчф;," .,ра выдержку спермы в е.е-н . процесса кристаллиэа 4 ции цел,:ообгаэно проводить не болееи не енеемин.В табл, 2,3 и 1 представлены экспериментальные данные по обоснованию граничных пределов скорости замораживания спермы, а также граничных преде ,ш ,. ;и.-:ей режима замораживания.; А ру, апример пс . снцио.Г". для контроля эа режимаэнн;-:,ня и замораживания, Об.ш ю на металлическую подс :, . ю в:-вою очередь, опус-р;идкого азота и охлаждают, .орс 4 ью 10-20 град/мин до начала :са к 1 .;алпизации, затем выдер,в,ют 1-3 мин и замораживают до О ( 6)-22 С со скоростью 25- эОр дд) (-80) - ( 90) С со ско .ь, Оград/мин и до -196 С "о цр.,з ,050рд/к,"лороженные образцы с учетом маркировки пе.15 1:енсят для постоянного хранения в.=.ую 4 ле кэнстры спермохраниобходимости используют м ,.е ню для искусственноо-;, - :,; кур;1 предназначено обоснова ределов скорости ох-.,ОО С до начала пронк ;, 4 ци и; р:.:д.явленные ь табл. 1, 5оо о том. что от 0 С до -: рце са кристаллизации спермур. зно охлаждать со скоростью:Представленные в табл. 2,3 и 4экспериментальные данные свидетельствуют о том, что наибольший выход функционально полноценных спермиев обеспечивается при замораживании спермыдо (-16)-(-22) С со скоростью 2530 град/мин, затем до (-80)-(-90) Ссо скоростью 50-70 град/мин и до-196 С со скоростью 30-50 град/мин.В табл. 5 представлены результатысравнительного испытания эффективности криоконсервации спермы петухов известным и предлагаемым способами.Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет повыситьвыход функционально полноценных. спермиев в 5,5 раза,Кроме того, при использованиипредлагаемого способа важно лишь выдержать укаэанные параметры охлаждения и замораживания спермы, объемэамораживаемых образцов, их форма,ип облицовки спермы не имеют значения. Это позволяет в отличие отизвестноно способа рационально использова гь полезную площадь спермохраи; пищ, проводить криоконсервацию:,ндивидуапьных эякулятов, а следовательно использовать предлагаемыйспособ в селекционно-генетическойработе.Формула иэобре енинСпособ криоконсервации спермыптиц, включающий ее разбавление, о:;паждение, эквилибрацию, замораживание, хранение в замороженном сос,тоянии, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения числа функционально полноценных спермиев, охлаждение спермы осуществляют со скоростью0-20 град/мин до наступления процесса кристаллизации, выдерживают в течение 1-3 мин, а замораживание осуществляют по ступенчатому режиму:до (-16)-(-22) С со скоростью 2530 град/мин, до (-80)-(-90) С соскоростью 50-70 град/мин и до -196 Ссо скоростью 30-50 град/мин,1524882 Табли ца 1 Спермии с повреждениями, 4 Функционально пол ноценные спермии,Скоростьохлаждения спермы, град/ акросомы головки еЕнин 96,7+0,8 97,011,4 91,6+1,8 77,6+1, б 71,6+2,6 69,0+2,5 78,62,0 89,9+2,1 422+1,4 40,0+23 3514 ф 0,2 31,3 ф 0,3 27,7 ц 0,5 25,1 ф 0,1 26 тй 0,9 24,7+1,1 25,5+0,8 27,2+1,2 3,3+0,8 3,0+1,4 8,4+1,8 22,4 1,6 28,4+26 31,0+2,5 21,42,0 17,13,0 10,1+2,17,0+2,1 Таблнца 2 Выход еуункцнонально полноценных сперме.:,ее1 Скоростьзаморакнаання стомы после к пород проведено замооаммьанне, Ст е -22 -23 Темгюратуоа-3 ее крмс- таллнзацмй,град/ммн еЭ,ЭЭЭ,З 16,ЕЗег 9,ОЕ 1,6 27,322,7 31,033,5 зо,а э, 20,3+3,0 21,132,2 13,4+2,9 10,73 е о 14,о 41,9 19,1.2 29,7 Е 31,ат 1,9 31 е 76).е 20,732, 17,012,6 12,2+ 1,а 9,1+ 1,711,931,3 16,7 т 4,1 6,8 тэег 19,4 ьэ,2 8,022,78,9 тгег 11,1 а 4,Э Таблмца Скоростзамораммеання от (.16)(-22) С,град/ммн Выход Функционально полноценных спермнее, Е Температура, до которой проведено занорамнеанне, С1524882 Т а б л и ц а 4Выход функционально полноценных спермиев, вСкорость замораживая от (-ЕО (-90) С до -196 С, град/мин Спермии с повреждениями,функциональнополноценныеспермии, Ф головки акросомы Табли ца 5 Биологически(функционально)полноценныеспермии, 3 Спермии с повреждениями,К-во изучен- Подвижностьных образ- спермы,цов, шт. баллы Способ криоконсервацииспермы головки, акросомы Известный 93Предлагаемый 106 41,713,4 90,2+5,4 9,Ы 5,4 4,1+0,2 4 ЗфО 3 23 9+2,1 45, 1+7 8 54,9 ф 7,8 Составитель И.МарченкоТехред М,Дидык Корректор Т.Малец Редактор Л.Веселовская Заказ 7166/4 Тираж 643 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035 Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент"г.ужгород ул.Гагарина, 101 20 25 28 30 40 50 52 60 33,7+2,8 32,0+2,8 23,9+1,9 25,0+1,9 23,9 ф 2,1 13,3 а 0,7 215+09 30,5+0,6 88,2+2,9 88,7+2,0 77,012,6 64,95,6 45,1+7,8 48,019,9 70,0+4,2 736+5 11,8+29 11,3+2,0 23,0+2,6 33 1+5,6 54,9+7,8 520+99 30042 263+5 2