Способ определения нарушений специфического т-клеточного иммунитета

/28-14 79. Бюл. У 41 кий научно-и т глазных бо ьца и Центр тельский инс им. И.И.Мечи дняков и А.Н (088,8) И,П Мап А ицическая ме107 в 1.(21) 426783 (22) 23.06. (46) 07.11. (71) Москов ский инстит им. Гельмго но-исследов и сывороток (72) В.И,По (53) 615, 3 7 (56) 1 Осипов ва В.Е. - Кл 1972, 1- 4,познающей илимфоцитовдостигаетсятигена гото следоватезнейльный на ьда разведений и устанавливают разницу между концентрациями антигеца,которые вызывают конгломерацию лейкоцитов в отсутствии и присутствиисодержащего трансфер-фактор лимфоцптарного ультрафильтрата, и при выявлешш снижения концентрации антигецав присутствии экзогенного трацсАерАактора более чем в 2 раза определяют недостаточность эндогеццого трансфер-фактора, а при выявлении отрицательной реакции конгломерации лейкоцитов определяют более глубокое нарушение - нарушение акцепцин трацсферЬактора, При этом в качестве источника эндогеццого трансАер-Аактора ис- Спользуют ультраАильтраты, приготовленные из смеси лимфоцитов от 50 илиболее случайно выбранных здоровых дфдоноров. Положительный эААект предлагаемого способа определения нарушенийантигепспециАического клеточного иммунинета состоит в дифференцированном р,определении нарушений антигенраспоэнающей и акцепторцой (по отношениюк эндогенному и энезогецному трансфер в Факто) функций Т-пимфоцитов.2 табл. тут вакци ико .Ма.Н., Туганодицина,НИЯ НАРУШЕНИИ ТОЧЧОГО ИММУН недостаточност) легочного пммунп приобретенной Изобретение О и ветеринарии, и бораторной иммун быть испо 1 тьзован носится к медицине еимушественно к ладиагцостике, и може для определения та при врождецнк 1 ммчноде ш итнос Ф ги, прп цнАеах, цапрпм р прп ренн ццонцы; иццруюпроце УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТИЗОБ ЧТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМГКНТ СССР(57) Изобретение относится к лабораторной иммунодиагностике в медицинеи ветеринарии и позволяет дать четырехстепенцую классификацию выраженности нарушений клеточного иммунитета ца основе диААереццированной оценки уровня антигенраспознаюшей функции Т-лимфоцитов и сохранности акцепторцой Функции Т-лимфоцитов в отношении эндогенного и экзогенного,трацсАер-Аактора. Целью изобретенияявляется повышение точности определения нарушения специфического Т в клеточного иммунитета за счет дифференцированной оценки уровня антигецрасакцепторной Аункций ТВозможность такой оцецклтем, что для каждого ацят по два одинаковых ря 1520447щей герпесвирусной, стафилококковойили туберкулезной инфекции.Цель изобретения - повышение точности определения нарушения специфи 5ческого Т-клеточного иммунитета эасчет дифференцированной оценки уровня антигенраспознающей и акцепторнойфункции Т-лимфоцитов по отношению кэндогенному и экзогенному трансферфактору.Способ осуществляют следующим образом.Способ основан на реакции конгломерации лейкоцитов свежевзятой кровипациента в присутстВии исследуемогоантигена. Для каждого антигена готовят по два одинаковых ряда разведений и устанавливают разницу между концентрацией, антигена, которая вызывает 20конгломерацию лейкоцитов в отсутствиии присутствии содержащего экзогенныйтрансфер-фактор лимфоцитарного ультрафильтрата, и при увеличении этойразницы более чем в 2 раза судят о 25недостаточности распознавательной иакцепторной функции Т-лимфоцитов,лежащей в основе дефицита специфического клеточного иммунитета. При этомиспользуют ультрафильтраты, приготовленные из смеси лимфоцитов от 50 илиболее случайно выбранных здоровыхдоноров,Способ включает следующие этапы,А. Выбор тест-антигенов.При конкретном осуществлении способа поставлена задача диагностировать нарушение клеточного иммунитета, специфичного в отношении антигенов трех произвольно выбранных пато 40генных возбудителей: вируса простогогерпеса (типы 1 и 11), микобактерийтуберкулеза и золотистого стафилококка. В качестве тест-антигенов используют коммерческие реагенты; жидкая герпетическая (тканевая, убитая) вакцина, содержащая обезвреженные Формальдегидом вирусы простого герпеса 1 и 11 типов, очищенный туберкулин - ППД (10 мкг/мл в 1 Е-йом цитрате натрия на 0,85 Х-ном хлориде нат 50 рия, очищенный стафилококковый белок А (10 мкг/мл в 1 Х-ном цитрате натрия на 0,85 Х-ном хпориде натрия).Б. Приготовление препарата трансфер-фактора.Препаратом, содержащим трансфер- Факторы, специфичные в отношении перечисленных антигенов, служит лиофи -лизированный ультрафильтрат, для приготовления которого используют человеческие миндалины, удаленные при хроническом тонзиллите. Взвесь лимфоцитов миндалин, содержащую пе менее 95 Х живых клеток, готовят не позднее 3 ч после тонзиллэктомии, очищают от адгезивных клеток фильтрацией через синтетическую (полиамидную) вату, осаждают центрифугированием (4008, 20 мин), ресуспендируют дистиллированной водой до концентрации 2 10 клеток в 1 мл и замораживаюто при температуре ниже,-20 С. Отдельные порции лимфоцитарного экстракта разомораживают при 37 С, объединяют так, чтобы смесь содержала экстракт из лимфоцитов не менее 50 доноров, разрушают клеточный детрит, пропуская взвесь через инъекционную иглу при помощи шприца, центрифугируют приО 6000 я в течение 1 ч при 4 С и декаптируют надосадочпую жидкость. Полученный экстракт подвергают ультра- Фильтрации при 0,15 МПа на мембране с ретенцией 15 КДа. Ультрафильтрат разливают по ампулам и лиофилизируют. Трансфер-Факторную активность ультрафильтрата контролируют в опытах индукции ГЗТ к трем указанным тестантигенам на мышах и золотистых хомячках.В. Постановка реакции.Методом оценки специфического клеточного иммунитета, а также акцепторной функции Т-лимфоцитов в отношении экзогенного трансфер-Фактора служит реакция конгломерации переживающих лейкоцитов (РКЛ) периферической крови, которую ставят следующим образом,Из кубитальной вены исследуемого индивида берут 4 мл крови в 1 мл 57-ного цитрата натрия и охлаждают на льду. В П-образные лунки 96-луночной панели для микротитрования помещают по 100 мкл 17-ного цитрата натрия в 0,857-ном хлориде натрия и готовят в этом растворе серию последовательных разведений с шагом 1:2 для каждого из тест-антигенов, Б ряду из 8 лунок 7 содержат последовательно убывающие разведения антигена, а 8-ятолько 1 Г-ный нитрат на 0,853-ном растворе натрия, Каждый ряд разведений всех трех тест-антигенав повторяют еще раз, пользуясь в качествеКак и в примере 1, у больного Е.Б.П. также обнаружены высокие пороги концентраций герпетической вакцины и туберкулина (ППД), вызывающие конгломерацию РКЛ и ареактивность в отношении стафилококкового белка И.Прибавление препарата трансфер-Фактор вызывало достоверное снижение пороговой концентрации герпетической вакцины, т,е. индуцировало иммунореактивность на антигены ВПГ 1 и 11, однако существенно не повлияло на результаты РКЛ со стафилококковым белком А и туберкулином (ППД). Такой результат интерпретирован как утрата Т-лимфоцитами больного Е.Б.П. акцепторной 552044разводящей жидкости 17-ным растворомцитрата натрия с 0,857.-ным хлоридомнатрия, содержащим препарат трансферФактора (т,е. лимфоцитарный ультра ф5фильтрат) в концентрации, эквивалентной 2 10 лимфоцитов в 1 мл. Такимобразом, для каждого обследуемого индивидуума на панели готовят по двесерии разведений каждого из трех 10тест"антигенов - одну серию безтрансфер-фактора, другую с ним. Затемв каждую лунку вносят по 100 мкл стабилизированной цитратом крови иссле- .дуемого индивидуума. После этого панель герметизируют адгезивной пленкой, закручивают крышкой и помещаютна качалку (120 качаний в 1 мин) при37 С на 2 ч.После инкубации из содержимого 20каждой лунки готовят по две "толстыекапли"объемом 50 мкл и диаметром20 мл на предметных стеклах и оставляют для высушивания при комнатнойтемпературе на горизонтальной поверхности. Во время приготовления препаратов "толстой капли" панель находится на термостатируемом подогреваемомстолике при 37 С. Высушенные препараты без Фиксации окрашивают 0,01 Х- ,30ным раствором метиленового синего,осторожно погружая предметные стеклав раствор красителя вертикально на10 мин,После окрашивания препараты извлекают иэ красителя и высушивают на35воздухе, Перед микроскопом всю поверхность окрашенных "толстых капель" .покрывают иммерсионным маслом дляпросветления и просматривают вдоль4 Опродольного диаметра с объективомх 20, отмечая численность лейкоцитов.в конгломератах, Определяют числолейкоцитов в трех самых крупных извстретившихся конгломератов. Именноэто число служит показателем конгломерации лейкоцитов в данной лунке,отражающим количество адгезивныхлейкоцитов в.исследуемой пробе крови и степень их взаимной адгезивности. Показатели конгломерации лейкоцитов в лунках, содержащих последовательные разведения тест-антигена, сравнивают с показателями 8-йлунки, которая служит контролем. Превьппение показателя на 2 и более единицы (клетки) расценивается как достоверное, Лунка, в которой наблюдается это отличие, содержит пороговую 7 6концентрацию тест-антигена. Сравнивая пороговые концентрации тест-антигенов, вызывающие увеличение показателей конгломерации лейкоцитов без трансфер-фактора и в присутствии трансфер-фактора, судят об его эффекте.П р и м е р 1. Представленные в табл. 1 результаты РКЛ с кровью больного Д.И.А., 19 18 г рождения, диагноз: рецидивирующий древовидный кератит с поражением стромы правого глаза, свидетельствуют о высоком пороге положительной реакции для всех трех тест-антигенов, что указывает на недостаточность клеточного иммунитета у данного больного в отношении соответствующих возбудителей. Однако способность Т-лимфоцитов пассивно воспринимать специфическую иммунореактивность (т.е., акцептировать экзогенный трансФер-фактор) сохранена, так как в присутствии лимфоцитарного ультрафильтрата наблюдается существенное снижение пороговой концентрации тест-антигенов, вызывающих положительную РКЛ.Пороговые концентрации тест-анти- генов, вызывающие достоверное увели-. чение показателя конгломерации лейкоцитов крови больного Д.10.А., приведены в табл. П р и м е р 2, Больной Е.Б.П., 1945 г. рождения, диагноз: кератоувеит левого глава.Пороговые концентрации тес-анти- генов, вызывающие достоверное увеличение показателя конгломерации лейкоцитов крови больного Е.Б.П., представлены в табл. 2.) 62,5 Снижение порога То же 1,6 Таблица 2 Интерпретация В пртдстствиитрансфер-фактора Без трансферфактора Тест-антигены Герпетическая вакцина (ВПГ 1 и 11) мкл/мл. Стафилококковыйбелок А мкг/мл .Туберкулин (ППД) мкг/млСнижение порога 62,5 250 Без изменений 50 Слабое снижениепорога 6,3 12,5 функции в отношении трансфер-Фактора, переносящего иммунореактивность к стафилококковому белку А и туберкулину (ППД).Положительный эффект использования5 предлагаемого способа определения нарушений антигенспецифического клеточного иммунитета состоиФ в дифференцированном определении нарушений антнгенраспознающей и акцепторной функции Т-лимфоцитов. Формула изобретенияСпособ определения нарушений15 специфического Т-клеточного иммунитета, включающий инкубацию свежевзятой крови исследуемого индивида с серией разведений тест-антигена и учет реакции конгломерации лейкоцитов при пороговой концентрации тест-ан 20 тигена, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью увеличения точности способа за счет дифференцированной оценки антигенраспознающей иакцепторной функции Т-лимфоцитов поотношению к эндогенному и экзогенному трансФер-фактору, инкубированиеисследуемой крови и тест-антигенадополнительно осуществляют в присутствии экзогенного трансфер-фактора,а учет реакции ведут по сравпениюпороговых концентраций тест-антигена, вызывающих конгломерацию лейкоцитов в отсутствии и в присутствииэкзогенногО трансфер-фактора и приснижении пороговой концентрациитест-антигена в присутствии экзогенного трансфер-фактораболее чемв 2 раза определяют нарушение акцепторной функции Т-лнмфоцитов, а приотсутствии конгломерации лейкоцитовопределяют нарушение антигенрасгознающей и акцепторной функций Т-лимфоцитов.