Способ определения изотипов антител

(19) (И) 981 А 1 е) 4 С 01 Л 33/53 1 11111 ;,;)эl1) 1". ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИА ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1.4(57) Нзобретени не, а именно к быть использован тител любого из соотношения их атно ситсмуноло г ии к медиции может елении анисима от активносри о типа, не ктивност изотип Целью ние точтью антител д табл. всем, кроме , и т. экспозиции смесей в удаления образовавш плексов и последующ зоб,), последующеи. течение 1, 5-2 ч, ихся иммунных комго определения носи ение зобре к медицине а имени Цель ние точлогии.ния явл ется повыше а тивности антител.Пример 1. Вь антиглобулиновых сыво дуемую сыворотку бол зом в разведении 1:3 10 частей по 0,2 мл. части смешивают с О, воротки (в разведени 1:200 соответственна шестую части - с ант бор разроток.ного оп с сторхот на е ервую мл ан етью сы:50, 1:100 ичетвертую1 О сывороткой нтиую - деткой в же разведенияседасти - с анти-сыва та вят ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТпО изОБРюениям и ОтнРытиймПРИ ГКНТ СССР(56) Авторское Р 1074531, кл. изобретения является пов ности определения антител раэ личных изотипов, независимо от соотношения их активности с активностью антител других изотипов.Поставленная цель достигается путем параллельной обработки исследуемой пробы до исследования смесями сывороток, каждая иэ которых содержит антитела к тяжелым цепям иммуноглобулинов всех, кроме одного, изотипов (одна сыворотка содержит а тела ко всем тя:елым цепям, кроме с, другая ка всем, кроме р, третья ко ности определения, Разработан способ определения изотипа антител, заключающийся в параллельной обработке исследуемой пробы смесями сывороток, каждая из которых содержит в заранее подобранных до з ах антитела к тяжелым цеплм иммуноглобулинов всЕх, кроме одного иэотипов. Смеси выдерживают в течение 1,5-2 ч при 37 С, вносят в них полиэтиленгликоль 6000 до конечной онцентрации 1,57 Полученные смеси после экспозиции в течение 0,5-1,0 ч при 18-22 С центрифугируют на холодуов течение 20-30 мин при 20 тыс. об/мин и полученнь 1 е варианты надосадков исследуют серологически в сравнении с необработанной сывороткой (контроль). Способ обеспечивает точную характеристику активности антител каждого из известных основных изотипов.тех же разведениях, десятую часть с таким же объемом 0,857-ного раствора хлорида натрия (контроль), Все части выдерживают в течение 2 ч при 37 О С. Затем удаляют образовавшиеся иммунные комплексы. Для этого в каждую часть вносят по 0,4 мл 37.-ного раствора полиэтиленгликоля 6000. Через 30 мин смеси центрифугируют при 200 тыс. об/мин в течение 20 минНадосадочные жидкости исследуют (каждую в четырех повторностях) при помощи РПГА с описторхозным диагностикумом. 15Результаты приведены в табл. 1,Из табл. 1 видно, что наибольшее снижение активности антител в исследуемой сыворотке происходит в результате обработки каждой антиглобулинной 20 сывороткой в разведении 1/100. Следовательно, каждая из смесей антиглобулиновых сывороток должна содержать соответствующие сыворотки в разведении 1/100. 25П р и м е р 2. Выбор условий экспозиции исследуемой сыворотки и смеси антиглобулиновых сывороток. Обработку сыворотки больного описторхозом смесью анти-- антисывороток проводили аналогично примеру 1. Отличия заключались только в различных условиях экспозиции исследуемой сыво - ротки со смесью указанных антиглобулиновых сывороток.35Результаты приведены в табл. 2.Титр общей активности антител до обработки смесью антиглобулиновых сывороток составлял 1:800. Наибольшее снижение титра РПГА произошло при 40 37 С и экспозиции не менее 90 мин. Значительное увеличение экспозиции технически нецелесообразно . Следовательно, оптимальными условиями экспоо зиции являются температура 37 С и 45 длительность обработки сыворотки 1,5-2 ч.П р и м е р 3. Исследованы при помощи РПГА сыворотки крови двух больных аписторхозом (А-а и Д-й) и50 одного больного дизентерией (П-а),По известному способу каждую исследуемую пробу сыворотки титровали, начиная с разведения 1".6, в объеме 0 025 мл в четырех рядах. Во все лун 55 ки первого ряда (контроль) внесли в объеме 0,025 мл растворитель - забуференный, рН 7,2, 0,853-ный раствор хлорида натрия. Во все лунки второго ряда в том же объеме внесли анти-сыворотку в заранее подобранном раз"ведении 1:100, третьего ряда - анти-Юсыворотку в заранее подобранном разведении 1:100, четвертого ряда - анти- р сыворотку в заранее подобранномразведении 1:100. После выдерживаниясмесей при 37 С в течение 30 мин вовсе разведения сыворотки больныхописторхозом внесли по 0,025 мл 0,53 ного описторхоэного, а рядов сыворотки больного дизентерией - дизентерийного антигенного эритроцитарного диагностикума. Результаты учли через2 ч (табл. 3) . Исследование каждойсыворотки провели дважды,По предлагаемому способу исследуемую пробу сыворотки в разведении 1:3разделили на четыре части по 0,2 мп.В первую часть (контроль) внесли0,2 мл растворителя (забуференный,рН 7,2, 0,0852-ный раствор хлориданатрия), во вторую - 0,2 мл смеси,содержащей анти- К (1:100) и анти(1;100) и анти- /и(1:100) сыворотки,в четвертую - 0,2 мл смеси, содержащей анти-(1:100) и анти- Ы.(1:100)сыворотки. Смеси выдерживали при 37 Св течение 2 ч. Затем в каждую смесьвнесли по 0,4 мл 37.-ного раствораполиэтиленгликоля 6000. Через 0,5 чпосле этого все четыре смеси центрифугировали при 20 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкостькаждой пробы титровали в одном рядус разведением 1:12 в объеме 0,05 мл.Во все разведения каждой сывороткивнесли по 0,025 мл 0,57-ного соответствующего антигенного эритроцитарного диагностикума. Результаты учли через 2 ч (табл. 3) . Исследование каждой сыворотки провели дважды.По известному способу обработкаанти-сывороткой, возможно, снижает титр РПГА, но последний точноучесть не удается, так как слабая агглютинация (на 1+ или 2+) продолжается дальше - до 1:96 - 1:144 посравнению с четко (на 3+ или 4+) выраженной агглютинацией - до 1:48.Даже если весьма условно учитыватьреакцию только на Э+ и 4+, оценитьизотиповую принадлежность антител висследуемой сыворотке можно было бытолько приблизительно - сравнениемрезультатов в колонках 3-5 с конт э 698рольным результатом (колонка 2 табл. 3). На этом основании можно было бы только судить о том, превышает ли активность антител, относящихся, например, к иэотипу 1 яС, активность антител других изотипов. По такой ориентировочной оценке можно полагать только, что активность 18 С антител в сыворотках, вероятно, вьпце активности антител других изотипов. По известному способу антитела изотипов 1 яА и 1 яМ у больных описторхозом не выявлены, а у больной дизентерией выявлены только 18 М антитела.По предлагаемому способу в исслецованных сыворотках больных описторхозом активность антител к описторхозному антигену содержится, в основном, в изотипе 18 С: инактивация антител других изотипов - 18 А и 18 (колонка 7 табл. 3) не снижает или почти не снижает титр РПГА по сравнению с контролем. Существенно меньшая активность антител содержится в иэотипе 18 М (колонка 9) и особенно в иэотипе 18 А (колонка 8), но антитела этих изотипов четко выявляются. В сыворотке больной дизентерией по предлагаемому способу определена наибольшая активность антител изотипа 18 М, меньшая - 18 С и минимальная - 1 яА.Исследованная сыворотка больной дизентерией была разделена на фракции на колонке с сефадексом С 200. Получены три пика - 1 яМ, 1 еА и 1 яС. Исследование активности антител в каждом из этих пиков показало, что в сыворотке наиболее высока активность 1 яМ антител, но активность антител, хотя и менее выраженная обнаружена в пиках 18 С и 1 яА. Таким образом, результаты, полученные предлагаемым способом, находятся в более точном соответствии с результатами иммунохимического фракционирования сыворотки, чем результаты, полученные известным способом. По предлагаемому способу можно выявить активность антител двух и более изотипов в тех пробах,где по известному способу определяются антитела только одного изотипа, Активность антител любого изотипа может быть четко оценена независимо от ее соотношения с активностью антител других иэотипов.Предлагаемым и известным способами параллельно исследованы с иммуно О реагентами соответствующей специфичности сыворотки крови 24 больных сразличными диагнозами, 18 М антителавыявлены у 18 и 10 больных по предлагаемому и известному способам соответст венно (различие достоверно: Р = 0,016)1 РС антитела - у 21 и 5 больных (Р(с10 ), 1 яА - у 14 и 2 больных (Р0,0007). В целом антитела двух итрех иэотипов в одной сыворотке об наружены известным способом в 2 и 0сыворотках соответственно, а предлагаемым - достоверно (Р ( 0,008 ) чащев 10 и 11 сыворотках. 0 том, чтопредлагаемый способ позволяет опреде лять антитела того или иного изотипатолько при их наличии в пробе, свидетельствует, что в трех сыворотках антитела вообще не были определены любым из двух способов.30 Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность определения изотиповой принадлежности антител. Формула изобретенияСпособ определения иэотипов антител путем приготовления несколькихсерий исследуемых проб сыворотки,внесения в них специфических антител 40 к тяжелым цепям иммуноглобулиновклассов А, С, М, инкубации смеси споследующей оценкой снижения титраантител, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения точностиопределения, в каждую исследуемуюпробу вносят одновременно смесь антител к тяжелым цепям двух классов иммуноглобулинов, а инкубацию осуществляют в течение 1,5-2 ч с последующим 50 удалением иммунных комплексов.1516981 Таблица 1 Специфичность антиглобулиновойсыворотки Титр РПГА при разведении антиглобулиновой сыворотки 1:100 1:50 1:200 Анти, Анти - О 250(4) 300 (2) 350 (2) 300(4)200 (4)175(2),250(2)200(2),250(2) 350(2), 400(2) 250 (4) Анти-300(4) Контроль (без антиглобулиновойсыворотки) 500 (2), 600 (2) П р и м е ч а н и е. В скобках указано количество опреде"лений,Таблица 2 Обратный титр РПГА при экспозиции, мин 60 120 Температура при экспозиции, С 180 240 90 600(1) 700(3) 600(4) 600 (4) 500(4) 300(1) 400(3) 500 (4) 20 300(1) 400(3) 37 П р и м е ч а н и е. В скобках указано количество определений. таблица 3 Обратные титры РПГА по способу Больные иэвестному п редла ге еиоиу Контроль После инактивации антител (18 С 18 А После инактивации антител а С Контроль 18 А 18 И 48 84 48 96 72 96 72 96 20 320 40 240Реакцию в калдои варианте выполняли двавды,+ФВ этих случаях титр реакции точно оценить невоэиокно А - а 44 144 Д-й 26 216 П - а 320 320