Способ получения никотинамидадениндинуклеотида

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А Н 19 207 50 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ. Ермол ельство 19/207 иде 81. л Изобре тном катионите, оставшиотделяют хроматографсновном анионите, а пось нуклеотидов отделяюменном декстрановом г нокисло пигмент сильноо кую сме анионооб е относится к вар й иа учен- на нство иному способу получениадениндинуклеотида (НАД тинамторой),сле" рименяется в научи в медицине,изобретения являетсяества целевого продуостигается тем, чтоделяют ультрафильтра ных ова киях 1. 5,0 л культуральгечЬассегдцт апвпоп 1- (5 -НАД 1,0 г/л) подверполых волокрые эадержи- .20000. Перлонку с карме. Объем П р и м е ой жидкости 8 епез (конц повыта.иопо ние ка л лимеры о фермента нах, зад кулярной хроматог еймбраолеосла гает ультрафильтрации на нах АРВ, ОАПУ, кото вают биополимеры с мол.м меат пропускают через ко тионитом КРС 4 и в Н -фо+ створа на вещества сыше 20000 и ног рживающихмассой св афической истки н ьВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИ НУКЛЕОТИДА(57) Изобретение .касается нуклеотидов, в частности получения никотинамидадениндинуклеотида, используемого в биохимических исследованиях.Синтез ведут из ферментационных растворов (содержащих биополимеры, нуклеотиды и пигменты), которые подвергают ультрафильтрации на мембранах,задерживающих вещества с мол.м. более 20000 (для отделения биополиме" ров) . Затем раствор хроматографируют сначала на сильном катионите, а затем на сильноосновном анионите (для отделения пигментов) с последую щим осаждением смеси нуклеотидов орнаническим растворителем, разделением на анионообменном декстрановом геле и осаждением целевого продукта низшим спиртом (этанолом). При этом учше отделять пигменты на аиионите марки ЛРАп-Т 40 с проведением сорбции в присутствии 0,05-0, 1 М раствора уксусной кислоты, а десорбции - 0,5-0,7 М раствором уксусной кислоты Смесь нуклеотидов лучше разделять на ДЕЛЕ-декстрановом геле, Эти условия повышают качество целевого продукта до содержания основного вещества с 85 до 983 при использовании исходных растворов с низкой концентрацией и меньшем в 3 раза расходе растворителя. 1 з.п. ф-лы.3 1505951к 1 чонки 5,5 л. Элюируют деминерали 1 ананна 1 водой. Фракции с рН 1,5-3,8,содержащие примеси (ЛТФ, ЛИФ и т,дпигменты), отбрасывают, Собирают НАД,10 л которого непосредственно пропускают через колонку объемом 1,5 лс анионитом АРАп-Т 40 в СНСОО -форме, уравновешенным 0,1 М СНСООН,НЛД десорбируют. 0,5 М СНзСООН (6,0 л) .10Раствор упаривают до 0,3 л, НАД выделяют осуждением этиловым спиртом3,0 ч. Осадок растворяют в 0,20 л деминерализованной воды и пропускаютчерез колонку с анионнообменником 15ДЭЛЭ 2,5 в СНСОО -форме, уравновешенным 0,01 М СНСООН. НАД десорбируют 0,1 М С 1 СООН (2)1 л), выделяютосаждением этилавым спиртом.Получают 4,4 г препарата (выход 20857) .НАД=99,77 (опред. по Я г 8 н о-НАД=98,0 Е (энз. анализ с АДГ),П р и м е р 2. 1,8 л культуральной жидкости бактерий Вгеч 1 Ьассегцважпопгадепез, содержащей 3,0 г/лНАД, подвергают ультрафильтрации намембранах (Рипор), задерживающихбиополимеры с мол .м. 20000. 30 Пермеат пропускают через колонку с катионитом КРС-Кп (Н-форма) (объем колонки 2,0 л), уравновешенным деюнерализованнай водой до РНЭлюируют деминерализованной водой, собирают фракции по 0,2 л. Фракции с рН 1,5-3,5, содержащие пигменты и компоненты нуклеиновых кислот, отбрасывают. Собирают фракции, содержа щие -НАД:0,2 г/л, объемом 2,6 л, которые пропускают через анионит вСН СОО -форме, уравновешенный водой до рН 4,0, объем колонки 0,5 л. Колонку промывают 0,12 М СН СООН, десарбируют НАД 0,8 л 0,8 М СН СООН.Раствор упаривают до 0,1 л и осаждают этиловым спиртам ( 1:10) . Полученный осадок растворяют в 0,1 л деминерализованной воды и наносят на колонку с ДЭАЭ 2,5 в СН СОО -форме,50 уравновешенный водой (объем колонки 0,2 л), Десорбируют НАД О, 1 М СН зСООН фракциями по О, 1 л. Фракции, содержащие НЛД, осаждают этиловым спиртом и получают 4,5 л НАД с содержанием 98,7 Е (опредпо -НЛД 5 цц=18,7,10) и 6-ЛД 97,5 Е (энзим. анализ с ЛДГ) . 11 р и м е р 3. 10,0 л культуральной жидкости бактерий Вге 1 Ъассег 1 ов асппоп 1.арепев концентрацией НАД 1,4 г/л подвергают ультрафильтрации на полых волокнах ЛРВ, ОЛПУ, которые задерживают биополимеры с мол.м.20000.Пермеат пропускают через колонку с катионитом КРСп в Н вформе (объем колонки 1 О л), уравновешивают деминерализованной водой до рН 4,5. Элюируют деминерализованной водой. Фракции с рН 3,5, содержащие примесей (пигменты, компоненты нуклеиновых кислот и т.д,), отбрасывают, Собирают 20 л раствора, содержащего НАД, который пропускают через анионит ЛРАп-Т 40 в СНСОО -форме, уравновешенный 0,08 М СНСООН. НАД десорбируют 3,5 л 0,7 М СНСООН и из раствора выделяют осаждением этиловым спиртом (1:10), Полученный препарат содержит АДП-рибозу, АМФ и т.д, Осадок растворяют в 0,2 деминерали" зованной воды и наносят на ионообменный декстрановый гель ДЭАЭ 2,5 в СНзСОО -форме, уравновешенный 0,01 М СНзСООН. НЛД десорбируют О,1 М СНСООН, Первые фракции, содержащие примеси (нуклеотиды), отбрасывают.2,5 л раствора, содержащего НЛД, упаривают до 0,3 л, осаждают 3,0 л этакола.Получают 12, 1 г НАД (выхад 857) .Содержание НАД 97,5 Е (по Е НАД, 258 нм рН 2,0)Д-НЛД 96,5% (энэ.анализ с АДГ).П р и м е р 4. 3,0 л отсепарированной культуральной жидкости бактерий Вгеч 1 Ьасг. аввоп- аепез концентрацией 3-НАД 2,1 г/л подвергают ультрафильтрации на полых волокнах ЛРБ,0 АПУ, которые, задерживают биополимеры с мол,м. 20000. Пермеат пропускают через колонку с катионитом КРСп .в Нф-форме (объем колонки 3,2 л), уравновешенным деминерализованной водой до рН 4,0. Элюируют деминерализованной водой. Фракции с рН 3,6, содержащие пигменты и компоненты нуклеиновых кислот, отбрасывают (7,0 л) . Собирают НАД фракциями по 0,5 л. Общий объем раствора НАД 6,0 л, его непосредственно пропускают через колонку с подготовленным сильноосновным анно" нитом в СНзСОО -форме, уравновешен ным 0,05 М СНСООН. Адсорбированный НЛД элюируют 0,5 М СНзСООН (1,4 л)15059и вьделяют из раствора осажлениемэтиловым спиртом в соотношении 1:10.Осадок растворяют в деминерализованной воде и пропускают через колонку(объем 0,25 л) с анионообменным декстрановым гелем ДЭАЭ,5 в ацетатнойформе, уравновешенным 0,05 М СНСООН,Десорбируют НАД 0,1 М СНзСООН, Собирают фракции по 0,2 л. Первые фракции (0,7 л), содержащие примеси(объем 1,5 л), упаривают до 0,2 л иосаждают этиловым спиртом (2,0 л). 15Получают 5,0 г препарата, выход857.НАД=96% (опр. по Е НЛД,=18, 7. 10- ),256 нм Рй 0- НАД=-95,57 (энз. анализ с АДГ) . 20П р и м е р 5. 2,4 л культуральной жидкости "Вгеч 1 Ъасге г 1 щп апппоп 1 адепез" концентрацией НЛД 2,0 г/л подвергают ультрафильтрац".и нг мембранах "Рипор 4", которые задерживают 25биополимеры с мол,м. 20000, ПермеатПрОПускают через колонку с катионитом КРСп-Т 40 в Н -форме, Объем коФлонки 2, 5 л, уравновешивают и элн ируют деминерализованной водой. Лолучают раствор НАД объемом 45 л,который пропускают через анионит АРА 5 п-Т 40 в (ацетатной форме), уравновешенный 0,03 М СН СООН. НАД десорбируют 0,4 М СН 5 СООН (1,2 л) и вьделяютосаждением этиловым спиртом. НЛД растворяют в деминерализованной воде ипропускают через колонку объемом0,25 л с декстрановым гелем ДЭАЭ 2,5в ацетатной форме (рН 4,1) . НАД де Осорбируют 0,1 М СНСООН. Собираютраствор НАД 1,2 л, который упариваютдо 0,2 л и осаждают этиловым спиртом2,0 л.45Получают 28 г препарата (выход6 ОЕ).НАД 95,3 Ж (опред.по Е НАД=710 ) .-НАД 94,17 (энз. анализ с ЯГ),П р. и м е р 6. 6,3 л культуральной жидкости бактерий Вгеч 1 Ьассгег 1 цш апшюп 1 аепев, содержащей 1,5 г/л-НАД, подвергают ультрафильтрациина полых волокнах АРВ0 АПУкоФф 55торые задерживают биополимеры смол.м.20000.Пермеат пропускают через колонкус катионитом КРС-Кп в Н -форме,4. 51о(объем колонки 7,0 л), уравновешивают деминерализрнанной водой до рН4,2, Элюируют деминерализованной водой, Фракции с рН 3,5, содержащиепримеси (пигменты, компоненты нуклеиновых кислот и т.д.), отбрасыва -ют. Собирают 14,0 л раствора, содержащего НЛД, который пропускают черезанионит ЛРЛп-Т 40 в ацетатной форме, уравновешенный 0,08 М СНСООН.НЛД десорбируют 0,6 М СНэСООН (2,6 л).НЛД из раствора выделяют осаждениемэтиловым спиртом (1:10). Полученныйосадок растворяют в 0,2 л деминерализованной воды и пропускают через колонку с ДЭЛЭ 2,5 в СН; СОО -форме,уравновешенный 0,0 1 М СНСООН, Десорбируют НЛД 0,1 М СНСООН. Первые фракции, одержащие примеси, отбрасывают,1,8 и раствора НАД упаривают и выделяют осаждением этиловым спиртом=18, 7. 10 ),Р -НЛД 98,37 (энэим, анализ с АДГ).Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качество целевого продукта, увеличить его содержание с 85 до 987., вьделить целевой продукт из ферментационных растворов с низким его содержанием в исходном сырье, сократить расход органического растворителя в 3 раза,Формула изобретения1.Способ получения никотинамидадениннуклеотида из ферментационных растворов, содержащих биополимеры, нуклеотиды и пигменты, включающий хроматографическую очистку и осаждение целевого продукта органическим растворителем, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью повышения качества целевого продукта, ферментационыый раствор подвергают ультра- фильтрации на мембранах, задерживающих вещества с молекулярной массой свыше 20000 с целью отделения биополимеров, полученный раствор подвергают хроматографической очистке сначала на сильном катионите, а затем, с целью отделения пигментов - насильноосновном анионите с последую- Гщим осаждением смеси нуклеотидов органическим растворителем, разделе1505951 Составитель Г.КонноваЪТехред М.ХоданичКорректор М.Васильева Редактор Н.Гунько Заказ 5390/25 Тирак 338 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уагород, ул. Гагарина,10 нием последних на анионообменном декстрановом геле с последующим оса)кдением целевого продукта низшим спиртом, 52. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что отделение пигмента проводят на сильноосновном анионите марки АРАп-Т 40, причем сорбцию проводят в присутствии 0,050, 1 М раствора уксусной кислоты, а де,сорбцию 0,5-0,7 М раствором уксусной кислоты, и полученную смесь нуклеотидов разделяют на ДЕАЕ-декстрановом геле.