Способ получения ферритин-специфических антител

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИА ЛИСТИЧЕСН 8)9) ЯО ) 1 УБЛИН ЩгРЕСПЙ=ОСУДАРСТВЕННЫЙ Н 1 К 33 53 5)5 Е О ИЗОБРЕТЕНИЯМРИ ГКНТ СССР ОТНРЫТИЯМ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТА ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(72) С, П. Мдр) А, В. Чейкица, Н. В, Ливень и иоргднической химии в, Г. И. Лепешева, И. Вдсилевскнй, П. Вигдорович 5 Ь) Сомдп Б. 1.1 с Епегеу Адепс о 1. 1, р. 347-3 1. 1 пегп, АСеппд, 1979,му ель - улерритицИэобр ому мик ольэовд иотехно стик к е чис Спос еских ара ител элюц(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРРИТИ 11-СПЕЦИФИЕСКИХ АНТИТРЛ(57) Изобретение относится к медицинскому микроднализу, а именно к имнорадиометрическому определению ферритина, и может быть использовано вклинической биохимии, биотехнологиии медицине для диагностики ряда заболеваний гемдтологического и онкологического профилей. И учшениекачества получаемых Ф специетенне относится к медицинсроанализу н может быть исно в клинической биохимии, логии и медицине для диагнода заболеваний гемдтолбгичесцкологического профилей, изобретения является улучшеоты целевого продукта.б получения Ферритнн-специфи" нтител заключается в том, что Ферритин-специФических анолучдемый с помощью кислотной ферритин-сефароэы, очищают фических антител. Поставленная цельдостигается способом, включающим инкубацию сыворотки крови иммунизированных кроликов с Ферритином, ковалецтно связанным о Р)гСЛ-активировдн-цой сефдроэой 4 В, отмывку балластныхбелков буферными растворами нейтральных рН при варьировании ионной силы(1)1 дС 1 0,2-1 М) и с добавлением детергецта (О,ЗХ-ный твин), элюцию ферритин-специфических антител растворамис кисльии значениями (рН 3 - элюцияантител низкой дффицности, рН 2,3элюция высокоаффинных антител) и ддсорбциоцц о хроматографию препаратаантител на гранулировдниом нолидкрилдмидном носителе (биогель, дкрцлекспозволяюпую удалить примесные продукты кислотной деструк),ии Ферритина,В результате достигается уменьшениевремени анализа при сохранении показателей его чувствительности, точности и достоверности. от продуктов деструкции Ферритина с Юпомощью дополнительной хроматографии .ОО на гранулировацном полцакрилдмилцом носителе (например, нд биогеле Р ипи акрилексе). Хроматогрд)1)ию на поливкриламидном носителе проводят, присыпая расчетное количество сухого гранулированного носителя в раствор фер- фф Ритин-специФических дтител, что приводит к быстрому идбухдции гранул геля и прочной длсорбции продуктов де" струкции ферритицд нд матрице полидкриламидного полинед, в то время08 3 15035как фсрритин-специфические антителав данных условиях остаются несвязанными с матрицей полиакриламидногогеля, Кроме того, с помощью биогеляудается сконцентрйровать препарат5антител в 3-6 раз, что также весьмасущественно для их последующего использования в количественном иммунометрическом анализе. 1 ОП р и м е р 1. Получение ферритин-специфических антител заявляемымспособом.Для получения аффинного адсорбента Ферритина селезенки человека иммобилизуют на С В-сефароэе 4 В стандартным методом, инкубируя С В-сефарозу4 В с ферритином 3 ч при комнатнойтемпературе и РН 8,3. Концентрацияиммобнлизованного ферритина составляет 7-10 мг/мл уплотненного геля. Сыворотку крови кролика, содержащую антитела к селезеночному ферритину человека, получают путем иммунизациикроликамл раствора, состоящего из 25смеси 0,5 мл адьюванта фрейида и0,5 мл физиологического раствора, содержащего 100 мкг ферритина из селезенки человека. Инъекции проводят синтервалом в одну неделю 3 раза, за" 30тем через 3 недели осуществляют четвертую инъекцию и спустя 10 сут начинают отбор кровй у животных, Получен -ную антисыворотку (Э мл) смешивают смл уплотненной ферритин-сефарозы идобавляют 3 мл буфера, содержащего0,05 М трис-НС 1 и 0,2 М хлористого на"трия, рН 8,0. После перемешивания втечение 1, 5 ч при комнатной темпера"туре осадок ферритин"сефароэы отделяют центрифугированием при 1500 д втечение 3 мии и промывают последовательно 20 обьемами каждого иэ следующих растворов:0,05 М трис-НС 1, рН 8,0 (буфер А) 45содержащий 0,2 М хлористый натрий;буфер А, содержащий 1 М хлористыйнатрий;буфер А, содержащий М хлористыйнатрий и О,ЗХ твин;буфер А, содержащий О,И хлорнсзый натрий,Все промывки и последующую элюциюпроводят в бэч-варианте, т.е. перемешиванием суспеиэии сорбеита в обьеме раствора. Освждение Ферритин-сефароэы проводят центрифугированием,как описывалось выше. Элюцию ниэкоаффинных антител проводят 8 мл 0,05 М глипип-НС буфера, содержащего 0,2 Ихлористый натрий, РН 3,0. Высокоаффинные антитела элюируют в 2 этапа0,05 И глицин-НС 1 буфером, содержащим0,2 И хлористый натрий, РН = 2,3 (по8 мл).К раствору высокоаффинных ан-тител (б мл) присыпают 500 мг биогеля Р (200-400 меш), перемешивают5 мин при 0 - 2 С и центрифугируют15 мин при 7000 я., Супернатант с концентрацией белка 200-800 мкг/мл собирают, доводят РН до 7 Ь,0 и используют как препарат высокоаффинных Ферритин-спецнфич ых антител,Получение Ферритин-специфическихантител с помощью известного способапроводят по примерудо стадии кислотной элюции. Элюцию проводят с помощью раствора с РН 3, О по примеру 1 ина этом заканчивают процедуру получения антител.П р и м е р 2. Проведение количественного иммунорадиометрическягоопределения Ферритина с помощью препарата ферритин-сцецифических антител,полученных э ачвля емым с посо бом,В пробирку вносят 250 мкл раствора подогена (4 мкг) в хлороформе нхлороформ выпаривают в токе аргоиа.Затем в ту же прббнрку вносят Г,52 мКн 11 ав объеме 40 мкл 0,2 Г 1трис-НС 1, рН 7,5 н 100 мкг ферритинспецифичных антител в объеме 200 мклО, 1 И трио-НС 1, РН 8, О, содержащегоО, И хлорнстый натрий. Смесь инкубируют 10 мин при комнатной темпе рат уре, после чего" 1 меченые антителаотделяют от непрореагировавшего "41гель-кроматографией на ТБК-геле НШЬО .иМ"1-меченые Фер ритин-с пе цнфич ес к неантитела используют в иммунорадиометрическом определении ферритина, Дляэтого в пробирки вносят ферритин вколичестве 0,1 - 25 нг на пробирку.что соответствует концентрации ферритина в исходном растворе 5 - 500 мкг/лЗатем добавляют ОО мкл ферритин-специфических антител, меченых изотопомф 1 (по О, 03;О, ОВ икКи ипи 5 - 18 нгантител) и 100 мкл 0,05 М натрий-Фосфатного буфера, содержащего 1 Х бычьего,сынороточного альбуиина и 0,020,02 Х азида натрия. После ннкубацииов течение 3 ч при 8 " 25 С или 1 чпри 37С в про бирк и добавл яют 100 лил1 ОХ-ной (мас. /об.) суспенэви иммуно15 П 3508 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 сорбецтд, содержащего дцтителд к селезецочцому Ферритццу, иммобилцэондцттьте ца мтткрокрттстдллическотт ттеллюлоэе, и встряхцо,тютч ттрн8 - 25 С,, Затем суспецзито цецтрифугируют 15 минпри 2000 я, осддки промывают 2 мл дистиллцровднцой воды и повторно осаждзот. В полученных осадках определяютскорость счета радцонуклцдд1, отражающую количество связанных с имму"носорбентом комшчексов Ферритина соспецифическими дцтителдми. В своюочередь этот показатель закономерносняэан с количеством ферритина, добавляемого с исследуемым раствором.Количественное иммунорддиометрическое определение феррцтинд с помощьюпрепарата ферритиц-специфических антител, полученного известным способом,андлиз и обработку результатов проводят по примеру 2.Улучтпение качества антител, которое влечет за собой сокращение времени анализа, достигается без потериего чунствительности, точности и достоверности. В большинстве иэ перечислецньм покдэатеттей анализ с применением антител к ферритину, полученныхзаявляемым способом, имеет некоторыепреимущества.П р и и е р 3. Проверка качествапрепарата антител, полученного заявляемым и контрольным способами, вконкурентном тесте,Конкурентный тест представляет собой определение особенности препаратаантител конкурировать в иммунорадиометрической системе с 1-меченымиантителами за связывание с ферритииом. 1-мечеттьте антитела, а такжеиммуносорбент, используемъте н иммунорадиометрической системе, получаютс помощью стандартной методики, описанной в примере 2. При проведенииконкурентного теста в пробирки вносят по 100 мкл раствора ферритина сконцентрацией 100 мкг/л. Затем добавляют 100 мкл 107-ной (мас,/об.) суспензии иммуносорбента и 200 мкл стандартного буферного раствора (0,05 Инатрий-фосфатный буфер, содержащий1 Х бычьего сывороточного альбуминаи 0,022 аэида натрия). После инкубации в течение 1,5 ч при 18-25 С и постоянном.встряхивании суспензию центрифугируют 15 мии при 2000 В, осад ки промывают 2 мл дистиллированнойводы и повторно осаждают. К осадкам прибаяляктт ио 100 мкл рдГттторд, содержащего 10, .00, 500 и 1000 иг тестируемьтх феррититт-сттетттт 1 тт теск ттх дттч ттел, что соотоетстоует коиттситрдцицферритин-специфических дтттитеч о исходном растноре 0,1, 1,5 ц 10 мг/мл соответственно, Здтем о каждую проку.тбирку нносят 100 мкл 1-меченых Ферритин-специфических антител со скоростью счета 50 тыс, имп, /мцц и 200 мкл стандартного буфера. Суспенэию остряхинают 2 ч при комнатной температуре.,)атем ее центрифугируют 15 мин при2000 я, осадки промывают 2 мл дттстиллированной воды и повторно осаждают,В полученных осадках определяют скорость скета радиоцуклида 1, отражающую количество связанттых с иммуносорбентом комплексов Ферритица со1-меченными антителами т,контрольная проба), а также способность исследуемых препаратов антител конкурирондть с 1-меченными антителами эа свяэытч 5нацие с Ферритином.Снижение связанной с иммуцосорбецтом радиоактивности при увеличении в среде инкубации концентрации дцтител, полученных заявляемым способом, снидетельстнует о конкуренции немечецьмацтиле с меченьпти зд связт,тнтттие с ферритицом, который в свою очередь биоспецифически связан с иммобилизованными иа целлюлозе антителатот. Сте" пень снижеиия связанной с Иммуиосор - бецтом радиоактивности при увеличении концентрации конкурирующих антител отражает дффиттность антител,Таким образом, ддццый пример покэзьтндет, что эаянляемьпт способ ттозноляет удалить иэ препдрдта Фетунтттттспецифических антител продукты дест" рукции ферритина, которые прцсутствуют, как следует из примера, в препарате, полученном по известному способу.Анализ экспериментальных данных гримера 3 показывает, что положитель" ный эффект заявляемого способд н сравнении с прототипом заключается в улучшении качества антител, что приводит к уменьшению оремени анализапри сохранении показателей его чувствительности, точности и достоверности. Формула изобретения Способ получения фсрртттитт-специфических антител путем проведения хроЗаказ 571 Тирак ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГЕНТ СССГ113035, Иосквв, %-35, Рауаская наб., д. 4/54 Производственно"издательский комбинат патент", г.уагород, уи. Гагарина, 1(1 матографии иммунной .выворотки на ферритине, ковалентно связанной с сефарозой, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повыпения чистоты целе 5 вого продукта, после хроматографииосуществляют адсорбционную хроматографио на гранулированном полиакриламидном носителе.