Способ определения эринита, нитросорбида и продуктов их биотрансформации в крови

(1: 1.4808,9 А 61 К 3 ГОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТ ТНРЫТИЯ цри в 5 1 аП 4156627/280112.8623.05.89. БНаучно-исслксперименталии(46 (71 довательскии инстиьной и клинической ут ра Ш.А,Топчиев .Чумбуридзе 612.015 (08(54) СПОСОБ ОП НИТРОСОРБИДА И ФОРМАЦИИ Б КРО ЕЛЕНИл ЭРИНИТА,ОДУКТОВ ИХ БИОТРАН экстрагируют хлороформом с последующей обработкой хлороформного слоя их 0,01 н. раствором хлористоводороднойкислоты, хлороформный слой обезвоий живают сульфатом натрия и упариваютдосуха, после чего сухой остаток о- растворяют в смеси метанол - 0,01 н,раствор хлористоводородной кислоты и 25:75 с последующим определением исследуемого лекарственного веществаи продуктов их биотрансформации на. высокоэффективном жидкостном хромауществл ется следующ Спосо образом. Биоло больногокость (кровь ают буферным трия с рН 9,куюабат ч раст 18 ом тетрабората ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Изобретение относится к медицине в частности к способам определения эринита, нитросорбида и продуктов биотрансформации в крови человека для фармакокинетических исследован больных ишемической. болезнью сердцаЦель изобретения - разработка сп соба определения эринита, нитросорбида и продуктов их биотрансформаци в крови.На фиг.1 изображена высокоэффективная жидкостная хроматограмма эри нита и продуктов его биотрансформации в крови больного; на фиг.2 - высокоэффективная жидкостная хроматограмма нитросорбида и продуктов его биотрансформации в сыворотке крови больного.(57) Изобретение может быть использовано в медицине для исследования фармакокинетики зринита и нитросорбида в организме. Для этого используют способ высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке ЯрйегзогЬ 5 р с подвижной фазой метанолфосфатный буфер при соотношении 40;60 а детектирование проводят по оптической плотности при200 нм, Способ позволяет определя эринит и два продукта его биотрансформации и нитросорбир и три его метаболита, 2 ил,габл. тографе.Определение сложных эфиров азотной кислоты проводят на высокоэффек тивном жидкостчом хроматографе А 1 гех(США), колонка БрЬег 1 зогЬ 5 р длина колонки 25 см, диаметр 4,6 мм, заполненной обратнофазным нитрильным сорбентом с применением УФ-детектора при=200 нм, скорост элюирования 1 мм/мин, чувствительность 0,02, 1480819В качестве подвижной фазы используют смесь метанол; фосфатный буфер40:60.Для количественного анализа препаратов нитрогруппы готовят растворы5исследуемых препаратов в.смеси метанол,1 Г 1 фосфатный буфер 40:60, содержащие в объеме 50 мкл 5, 10, 15,25, 100, 200 нг лекарственного вещества. Исследуемые растворы вводятмикрошприцем в хроматограф. Площадипиков на хроматограмме вычисляют пу,тем умножения высоты пика на ширинуна середине высоты. На основе полученных данных строят калибровочныйграфик, выражающий прямо пропорциональную зависимость между величинойплощади пика препарата на хроматограммах от количества введенноговещества. Минимально детектируемоеколичество эринита, нитросорбида иизосорбид-мононитрата 5 нг.Приготовление растворов стандартных образцов эринита, нитросорбида. 250,0100 г чистой субстанции помещают в мерную колбу емкостью 100 мл,добавляют 40 мл метанола, смешивают3 мин (эринит на кипящей водянойбане) до растворения и доводят 0,1 Мфосфатным буфером до метки (раствор А),10,0 мл раствора А(001 ) помещают в мерную колбу емкостью 100 мли доводят объем до метки смесьюрастворителей метанолфосфатный буфер40:60 (раствор Б,001 ).Приготовление О, 1 М фосфатногобуфера. 11,5 г чистой субстанцииаммония фосфорнокислого однозамещенного помещают в мерную колбу емкостью 1 л, прибавляют 400 мл бидистиллята, смешивают 3 мин и доводятобъем раствора бидистиллятом до метки, размешивают смесь на магнитноймешалке 10 мин.Приготовление буферного растворас рН 9,18 из стандарт-титра (натрийтетраборнокислый Иа В О 10 НОрН 9,18, 25 С). В мерную колбу переносят содержимое ампулы и растворяютв дистиллированной воде. После растворения содержимого ампулы обьемжидкости доводят до метки и тщательно перемешивают раствор,Приготовление подвижной фазы (метанол-фосфатный буфер 40;60). В мерную колбу емкостью 200 мл помещают80 мл метанола и доводят объем раствора до метки 0,1 М фосфатным буфером, смесь дегазируют в течение 5- 10 мин, Относительная ошибка определения лекарственных веществ не превышает +3,07Полнота экстракции из сыворотки крови лекарственного вещества 98,38 + 0,62 , Ошибка определения эринита, нитросорбида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в биологических жидкостях, вносимая в результаты при хроматографическом анализе и вычислении площади, под пиком не превышает 1,62 +0,62 ,Определение и расчет концентрации лекарственного вещества проводят по формулеа Ъ1000С7 1где С - концентрация лекарственноговещества, нг/мл сыворотки;а - найденное количество веществав объеме 50 мкл;Ъ - разведение;Ч - объем сыворотки, мкл.Методом ВЭЖХ в крови больных определены эринит и два продукта егобиотрансформации с временем удерживания 5 мин, 7,2 мин (фиг. 1 б.г),нитросорбид и три метаболита с временем удерживания 5,6 мин, 6,4 мин,7,4 мин (фиг.2. е.ж.и).Предлагаемый способ дает возможность определить нитросорбид и эринит в крови человека, обеспечиваетодновременное определение эринита,нитросорбида и продуктов их биотрансформации. Для определения достаточенобъем крови 0,1-1,0 мл, затрата вре"мени на обработку крови и. определение данным способом не превышает1,5 ч, относительная ошибка определения +3,72Способ поясняется хроматограммами эринита и нитросорбида послеэкстракции из крови человека (фиг.1и 2) и таблицей с метрологическимихарактеристиками способа,Формула изобретения.Способ определения эринита, нитросорбида и продуктов их биотрансформации в крови, включающий добавление буфера рН 9,18 к сыворотке крови при их объемном соотношении 2:1, экс такцию хлороформом при соотношении5 1480819 6хлороФорм:сыворотка й осаждение бел-. кой, ЪрЬегъвотЬ 5 рь заполненной обков смеси Оь 01 М НС 1, обезвоживания ратноФазным нитрильным сорбентом, и упаривания смеси, растворение полу- при этом в качестве подвижной Фазы ченнога осадка в смеси метанол - используют смесь метанол-ФосФатный 0,01 ИН С 1 при их соотнощении5буфер 40:60 с последуюдей регистра:75, введение подготовленной про- цней оптической плотности при длине бы В жидкостной хроматограф с колон- ВОлны Л 200 нм. Найдено,нг Внесеноькг Препарат Эринит 50,0 200,0 Нитросор,0бид 50,0 200,0 4,9 4,8 4,8 4,95 4,85 49,3 49 ь 7 49,65 49,0 49,7 199,0 198,0 198,5 199,5 198,0 4,9 4,8 4,9 4,9 4,85 49,3 49,0 49,3 48,0 48,5 199 ь 0 199,0 198,0 199,5 198,9 4 ь 86 Оь 0652 1 ь 34 13 Оь 1809 3 72 49,47 0,3114 0,6295 0,8644 1,75 198,4 06892 0,3473 1,9132 0,96 4,87 0,0447 0,9183 0,1241 2,55 48,82 0,5630 1,1532 1,5628 3,20 199,06 0,5809 0,2918 1,1625 0,811480819 б О УГоставитель В.Митюшин актор С.Патрушева Техред М.Дидык Корректор оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 ЗакаВНИИПИ 604/3 Тираж 644 ПодписноеГосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5